iMeta | 姚斌院士团队-解析肠道益生菌改善雌性生殖力

● 源自小鼠肠道的天然罗伊氏乳杆菌Y15（LRY15）可合成多不饱和脂肪酸（PUFAs）;

● 通过基因工程改造LRY15删除PUFAs合成酶Acps，抑制PUFA的生成;

● PUFAs介导LRY15增强卵巢功能的作用;

● LRY15合成的PUFAs可改善卵巢细胞的胞间连接功能，提高生育力。

卵巢功能障碍是女性不孕的主要原因，约占不孕不育总数的20%至40%。最新证据表明，肠道微生物及其代谢产物参与调控卵巢功能及雌性生育力。尽管肠道微生物与生殖力存在关联，但阐明特定益生菌如何调节卵巢功能或可为提升雌性生育力提供新的策略。

我们前期研究表明，褐藻寡糖（AOS）可增强卵巢功能并增加肠道有益微生物的丰度。本研究从AOS饲喂小鼠肠道中分离获得罗伊氏乳杆菌Y15（LRY15），并证实该菌能改善顺铂（CIS）导致的生育力低下小鼠的卵巢功能及雌性生育力。LRY15合成PUFAs，而敲除LRY15中酰基载体蛋白合成酶（AcpS）的菌株AcpS-KO抑制了PUFA合成。AcpS-KO菌株失去了改善卵巢功能和雌性生育力的能力，而补充二十二碳六烯酸（DHA）与LRY15一样能够增强卵巢功能，提高雌性生育力。

空间转录组测序分析表明，LRY15可修复卵巢细胞的胞间连接结构，从而增强卵巢功能及雌性生育能力。这些发现在PUFA合成酶Fads2基因敲除小鼠（Fads2^-/-）中得到进一步验证。综上所述，我们的研究结果表明：LRY15通过PUFA介导的卵巢细胞的胞间连接修复作用提升雌性生育能力，这凸显了益生菌干预作为改善卵巢功能和促进生殖健康的潜在治疗策略。

CIS+LRY15（1× 10⁸ CFU mL^-1；图1A及表S1）可恢复雌鼠动情周期和生殖力，具体表现为怀孕率及每窝活仔数均显著提高（图1B-D及S1F、G）。组织学分析表明，CIS+LRY15显著增加了原始卵泡和总卵泡数量（图1E、F）。同时，这些结果得到了卵巢组织中抗缪勒管激素（AMH ，卵巢储备功能的生物标志物）以及卵母细胞特异性蛋白[包括小鼠VASA同源蛋白（MVH）和生长分化因子9（GDF9）]的蛋白水平的支持（图1G和S1H）。此外，LRY15显著减少了闭锁卵泡的数量，而具有正常透明带染色的卵母细胞数量增加（图S1I-K）。此外，在体外受精（IVF）分析表明，CIS降低卵母细胞的受精能力，并抑制2细胞期、4细胞期及囊胚期的早期胚胎发育；而CIS+LRY15则能挽救这些发育过程（图S1L−N）。

为确定LRY15增强雌性生殖力作用的特异性，我们同时研究了从饲喂AOS小鼠肠道中分离获得的另一株罗伊氏乳杆菌Y20（LRY20）（表S1）。CIS+LRY20组的妊娠率[38/51（74.5%）vs. 45/52（86.5%）；p = 0.1420]及每窝活仔数（11.29 ± 0.5 vs. 12.62 ± 0.5；平均值 ± 标准误；p = 0.0296）均低于LRY15，表明LRY15具有特异性增强卵巢功能和雌性生育力的能力。LRY15和LRY20代谢物分析显示，LRY20菌体中的二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）含量显著低于LRY15（图S1O−Q）。因此，PUFAs可能是LRY15提高雌性生育力关键代谢物。

首先，我们对LRY15进行了基因组重测序（表S2）。PUFAs可通过厌氧聚酮合酶途径合成，该途径主要存在于微生物（包括细菌及某些真核生物如裂殖壶菌）。而且，我们meta-analysis分析表明，编码PUFA合成酶的基因广泛存在于微生物中，包括罗伊氏乳酸杆菌（表S3）。在LRY15中鉴定出了参与厌氧条件下PUFA生物合成的酶，例如AcpS（图1H和表S2）。敲除AcpS基因抑制LRY15细胞中PUFA合成，并获得AcpS-KO菌株（图1I及S2A、B）。与LRY15相比，AcpS-KO中的n-3多不饱和脂肪酸[α-亚麻酸（ALA）、EPA和DHA]以及n-6多不饱和脂肪酸[亚油酸（LA）、-亚麻酸（GLA）和花生四烯酸（ARA）]含量均显著降低（图1J），上述结果表明，AcpS基因敲除菌株中PUFAs合成已被成功抑制。

此外，AcpS-KO菌株丧失了改善CIS导致的怀孕率及每窝活仔数下降的能力（图1K、L及表S1）。CIS组与CIS+AcpS-KO组在不同发育阶段的卵泡数量相当（图S2C、D），MVH、AMH和GDF9蛋白水平也相近（图S2E、F）。与对照组（CON）相比，CIS组及CIS+AcpS-KO组的闭锁卵泡数量均有所增加（图S2G−L）。此外，CIS+AcpS-KO未能改善卵母细胞的受精能力及早期胚胎发育（图S2M−O）。

血浆非靶向代谢组主成分分析（PCA）显示不同处理组间代谢物存在显著差异（图S3A和表S4）。KEGG通路分析表明，CIS+LRY15中增加的代谢物主要富集于不饱和脂肪酸生物合成通路（图S3B、C）。VIP分析中显示，DHA是区分CIS+LRY15与CIS的十大PUFA相关代谢物之一，并在这些差异代谢物中具有最高的VIP评分（图S3D）。

随后，我们比较了CIS+LRY15与CIS+AcpS-KO组间的血浆代谢组，KEGG 分析表明，与CIS+AcpS-KO相比，CIS+LRY15组中不饱和脂肪酸生物合成途径在上调代谢物中显著富集（图S3E、F）。VIP分析进一步证实DHA是一种重要的PUFA相关代谢物，对组间区分具有重要作用（图S3G）。而且，与CIS组相比，CIS+LRY15组的血浆DHA水平显著升高；而CIS+AcpS-KO组中，DHA水平则明显降低（图S3H）。

随后，我们进一步探究卵巢PUFA水平的变化。卵巢组织靶向代谢组学分析表明，LRY15（而非AcpS-KO）可显著提高卵巢中DHA、EPA、GLA和LA的水平（图S4A−H及表S5）。综上所述，LRY15能够重塑血液及卵巢PUFA的代谢谱，其中DHA作为主要代谢物可能在其发挥有益作用中起关键作用。

进一步研究表明，补充DHA可显著增加每窝产子数（图S5A−C及表S1）。组织学分析表明，CIS+DHA显著增加了原始卵泡和总卵泡数量（图S5D、E）。这些结果得到了MVH、AMH和GDF9蛋白水平升高以及卵泡闭锁现象减少的支持（图S5F−M）。而且，靶向卵巢代谢组学分析表明，补充DHA可增加卵巢中特定多不饱和脂肪酸（PUFAs）的浓度，包括DHA、EPA、LA和ARA（图S6A−H及表S5）。IVF分析表明，DHA可增强卵母细胞的受精能力及早期胚胎发育能力（图S6I-K）。

此外，在正常小鼠（未进行CIS处理）中，LRY15、AcpS-KO和DHA处理没有改变怀孕率及每窝产子数（图S6L−N），表明这些处理对雌性生殖功能无不良影响。

为进一步解析LRY15改善卵巢功能和提高雌性生育力的机理，我们采用空间转录组测序技术对卵巢空间基因表达特征进行解析（图2A和S8）。

卵母细胞GO富集分析表明：与CON组相比，CIS组中表达下调的差异表达基因（DEGs），而与CIS组相比，CIS+LRY15组中表达上调的DEGs均显著富集于生殖过程相关通路，包括卵母细胞发育、雌性配子生成及卵子发生（图S9A、B），这表明LRY15能够恢复卵母细胞发育和卵巢功能所必需的转录程序。参与卵母细胞发育的关键基因H3f3a和Grb14在CIS+LRY15中表达显著升高（图S9C、D）。而且，在CIS+LRY15组卵巢细胞中，由P53驱动的卵母细胞凋亡信号通路相关基因集评分显著降低（图S9E-G）。同时，促凋亡标志物（包括P53和BAX/BCL2）的蛋白水平在CIS+LRY15组中均降低（图S9H、I）。CellChat分析进一步揭示，在CIS+LRY15组的卵母细胞中，胰岛素样生长因子（IGF）信号通路活性增强，尤其表现为卵母细胞与颗粒细胞之间Igf1-Igf1r配体-受体相互作用显著增加（图S9J−L）。已知该信号通路在卵泡发育过程中对防止细胞凋亡起着关键作用。

在颗粒细胞中，GO富集分析显示差异表达基因（DEGs）显著富集于生殖通路相关领域，包括排卵、骨形态发生蛋白（BMP）信号通路、类固醇激素生物合成以及卵泡发育（图2B）。基因集评分显示，在CIS+LRY15组中排卵通路评分显著升高，同时主要排卵标志基因Inhba和Inhbb的表达水平也显著升高（图S10A-G）。此外，与CON相比，在CIS中表达上调的差异表达基因（DEGs）主要富集于凋亡信号通路，反映了CIS诱导的严重细胞凋亡（图S10H）。同时，CIS+LRY15降低了细胞凋亡信号通路评分，并减少了γH2AX阳性及TUNEL阳性细胞数量（图S10I−N）。

为研究颗粒细胞亚型转录状态的变化，将颗粒细胞按其显著的转录异质性分为四种亚型（图S11A）。值得注意的是，主要分布于卵巢皮质邻近区域的亚型3表现出最高的CytoTRACE评分，表明其具有最大的分化潜能和转录多样性（图S11B、C）。其亚型特异性基因参与激素代谢过程（图S11D−F）。转录因子（TF）活性分析显示，在CIS+LRY15细胞中Nr5a1活性增强，这与其调控颗粒细胞分化及类固醇激素生物合成的作用一致（图S11G）。因此，CIS+LRY15可上调类固醇生成基因Cyp11a1和Cyp19a1的表达（图S11H，I）。而且，免疫荧光染色显示CIS+LRY15组卵泡中PCNA阳性颗粒细胞数量增多（图S11J、K）。

我们进一步探究了AcpS-KO与DHA对这些参数的影响。PCNA阳性细胞的比例在CIS与CIS+AcpS-KO组间相当，但在CIS+DHA组中高于CIS组（图S12A、B）。此外，DHA可减弱CIS诱导的TUNEL阳性细胞及凋亡相关蛋白数量的增加，而AcpS-KO则无此功效（图S12C−H）。结果表明，DHA在恢复因CIS损伤而受损的卵巢细胞功能方面与LRY15具有相似潜力；而AcpS-KO则仅表现出有限的保护作用。

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5卷1期

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