细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）及其他细胞外膜相关颗粒可参与病毒播散，但调控EV相关的病毒物质组成及感染性的宿主因子还未充分认识。本研究通过比较蛋白质组学分析发现，Eps15同源结构域蛋白4（EHD4）是在寨卡病毒（ZIKV）感染Vero细胞来源的EV/病毒颗粒混合制备物中富集的候选宿主因子。在HeLa细胞中敲除EHD4后，寨卡病毒、日本脑炎病毒及登革病毒2型的增殖均受到抑制，而重新表达EHD4可恢复病毒增殖。在ZIKV感染的EHD4敲除（KO）细胞中，与野生型（WT）细胞相比，有更高比例的病毒RNA存在于EV富集组分。然而，来源于KO细胞EV富集组分中的病毒物质的细胞结合能力和感染性均减弱，而部分破坏EV的膜结构后，WT和KO来源制备物之间的感染性差异有所减弱，提示膜相关成分参与决定其携带的病毒物质的功能特性。ZIKV复制子实验显示，EHD4对病毒RNA复制本身并无明显影响。免疫荧光结果显示，EHD4与CD63阳性区室及ZIKV包膜蛋白存在部分共定位。透射电子显微镜也观察到EHD4缺失并不影响多泡体（multivesicular body，MVB）的形成，WT细胞的MVB腔内可较容易观察到病毒样颗粒，而在KO细胞中则较少见，提示EHD4可能促进病毒相关物质向MVB腔内囊泡的分选。进一步的定量蛋白质组学分析发现，KO来源的EV富集组分中一部分膜相关蛋白的丰度降低。综合上述结果表明，EHD4是一种可影响黄病毒相关物质在EV富集组分中的胞外分配、组成及感染性的宿主因子。其作用的具体分子机制仍有待阐明。
图1. 细胞外囊泡（EV）/ 病毒颗粒组分的蛋白质组学分析鉴定出EHD4为寨卡病毒感染过程中的候选宿主因子
图2. EHD4 敲除可抑制寨卡病毒在细胞内的增殖
图3.EHD4 在体外促进乙型脑炎病毒与登革病毒 2 型的增殖
图4. EHD4 缺失改变寨卡病毒 RNA 在EV富集组分中的分布
图5. EHD4、CD63与寨卡病毒 E 蛋白的亚细胞定位及多泡体超微结构分析
图6. EHD4 缺失降低EV富集组分的感染性
图7. 蛋白质组学分析显示 EHD4 敲除细胞的EV富集组分蛋白组成发生改变
图8. EHD4 参与寨卡病毒相关组分胞外分布及感染性调控的机制模型
图S1. 差速超速离心法与商品化试剂盒分离得到的EVs的特征鉴定
图S2. 透射电镜对寨卡病毒感染细胞纯化所得EVs的形态学鉴定
图S3. HeLa 细胞经 siRNA 转染后的 mRNA 相对表达水平
图S4. EHD4 基因敲除 HeLa 细胞株的构建
图S5. 寨卡病毒 GZ01 株在野生型与敲除型 A549、Vero 细胞中的复制情况
图S6. 野生型与基因敲除型细胞来源EVs的特征鉴定
图S7. 野生型与 EHD4 敲除 HeLa 细胞来源EVs中寨卡病毒基因组全长编码序列的 RT-PCR 扩增
图S8. pcDNA - 人 EHD4 表达载体的质粒图谱
图S9. 基于纳米流式细胞术（nFCM）优化 Triton X-100 处理条件以破坏EVs膜结构