先别急着问“降没降”，一个更重要的问题是：它能不能先黏上？
以沙利度胺衍生物为代表的分子胶，可以结合cereblon（CRBN）——CRL4CRBN E3泛素连接酶（E3 ubiquitin ligase）的底物受体，并让某些原本不是CRBN天然底物的蛋白靠近它。
如果形成的三元复合物足够稳定，目标蛋白便可能被泛素化，随后进入蛋白酶体降解。
过去很多研究因此把注意力集中在最终结果：“这个蛋白有没有被降解？”
但这种思路可能漏掉一大批候选者。
该研究援引既往研究指出，某些CRBN分子胶体系中，目标蛋白结合能力只需提高大约2～3倍，就可能从“几乎不降解”跨越到“明显降解”。这意味着，没有出现降解，并不等于这个蛋白与CRBN毫无关系。
它可能只是结合得还不够好。 |
这正是该研究提出“潜在互作蛋白（latent interactor）”概念的价值：先找到那些已经处在CRBN“引力范围”内的蛋白，再通过药物化学优化，把一个弱相互作用推过降解所需的阈值。
于是，靶点发现的问题从“哪些蛋白能被现有化合物降解”，变成了“蛋白质组中有哪些表面，已经具备被CRBN分子胶利用的可能性”。
这个变化看似只是筛选终点不同，实际上改变了搜索空间。
一次筛8,363个锌指：能与CRBN结合的蛋白，比能被降解的多得多
研究人员首先选择了C2H2锌指（C2H2 zinc finger, ZF）蛋白作为试验场。
原因并不复杂。Ikaros、Aiolos、SALL4等经典CRBN新底物（neo-substrate）都含有锌指结构，而人类C2H2锌指转录因子家族又足够庞大，非常适合检验CRBN究竟有多“挑食”。
为此，研究团队建立了一种高通量蛋白互补分析体系——GluePCA（glue protein complementation assay）。
它的逻辑很直接：将二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase, DHFR）拆成两个片段，分别连接CRBN和待检测蛋白。如果分子胶让两者靠近，DHFR功能就会恢复，在甲氨蝶呤（methotrexate）选择压力下，酵母就能更好地生长。
换句话说，细胞长得越好，就意味着分子胶诱导的结合越明显。 |
研究人员首先筛查了8,363个单锌指构建体，覆盖1,407个基因。按照剂量依赖性、log2(fold change)>2以及校正后P值<0.01等标准，得到201个剂量依赖性结合命中。论文在整体分析中将这一结果概括为超过210个CRBN–MGD锌指结合者。
更值得注意的是，排名靠前的很多蛋白本来就是已知的pomalidomide底物，包括Ikaros、Aiolos、SALL4、WIZ、ZFP91、ZNF692等。
这等于给GluePCA做了一次现实世界的“盲测”：单纯看结合，确实能够把已知可降解蛋白从数千个候选中捞出来。
但研究人员很快发现，一个锌指并不能讲完这个故事。
他们进一步构建了包含5,293个双锌指结构、覆盖713个基因的文库，最终得到285个剂量依赖性结合构建体。其中出现了此前并未报道由pomalidomide招募的ZNF852和ZNF341；随后在哺乳动物细胞降解报告系统中，两者均表现出明显降解。
REST则提供了一个更有意思的例子。
REST的ZF2单独存在时能够与CRBN–pomalidomide结合，却没有明显降解；一旦把旁边的ZF3也放进构建体，ZF2–ZF3便出现了降解。
关键问题 决定一个蛋白能不能被降解的，可能不是那个直接接触分子胶的结构单元，而是它周围的结构环境。 |
一个锌指负责“握手”，旁边的锌指却可能决定这次握手有没有结果
为了弄清相邻锌指到底做了什么，研究人员对124个双锌指结合者进行了深度突变扫描（deep mutational scanning, DMS）。
这不是几十个突变，而是89,918个单点突变。
结果显示，在大多数构建体中，都存在一个占主导地位的主锌指（main ZF, mZF）。它负责与CRBN–分子胶界面直接接触。
但主锌指两侧的辅助锌指（accessory ZF, aZF）并不是无关背景。它们有时增强结合，有时反而削弱结合，而且这种作用并没有一个简单、保守的序列模式。
冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）进一步给出了结构证据。
SALL4和Ikaros复合物的结构显示，一个完整的识别单元可以扩展到连续三个锌指，即aZF–mZF–aZF。在SALL4中，研究人员还观察到主锌指后方的一段额外α螺旋；加入这段结构后，GluePCA测得的结合能力提高约1.4倍。
这让“降解决定簇（degron）”的概念变得更立体。
它不一定只是几枚关键氨基酸组成的短序列，也可能是一个由多个相邻结构域共同形成的三维表面。主锌指提供核心接触，而旁边的结构负责进一步稳定——或者破坏——整个三元复合物。
这也解释了为什么两个拥有相似核心G-loop的蛋白，面对同一个分子胶，却可能有完全不同的命运。
分子胶的选择性，不只是“把目标抓得更紧”，还可以让其他蛋白更难靠近
如果pomalidomide能够招募如此多的锌指蛋白，那么另一个问题马上出现：
怎样才能让一个分子胶只降解我们想要的那个蛋白？
研究人员用Helios选择性分子胶ALV2回答了这个问题。
在双锌指文库中，ALV2最明显地富集Helios以及与其相关的Eos（IKZF4）。但更有意思的不是Helios信号变强，而是几乎所有其他锌指蛋白的结合信号都明显下降，包括Ikaros、ZNF692和SALL4。
因此，ALV2的选择性并不只是“增加Helios结合”。
它同时在做另一件事：让大量非目标蛋白变得不适合结合。 |
3.6 Å分辨率的cryo-EM结构进一步显示，Helios辅助锌指中的I122、N125、V129、S133等残基参与形成这一特异界面。其中V129突变为丙氨酸后，相互作用几乎消失。
从药物设计角度，可以把这种策略理解为“正向设计”与“负向设计”同时发生：一方面稳定目标蛋白，另一方面制造空间或化学上的不匹配，把其他潜在底物排除出去。
这可能是分子胶选择性设计中一个非常值得重视的思路。
不再只比序列：AI开始在整个人类蛋白质组里寻找“长得像的表面”
锌指家族毕竟只是一个蛋白家族。
研究团队接下来提出了更大胆的问题：如果CRBN识别的是蛋白表面，而不是某段严格保守的序列，那么结构完全不同的蛋白，会不会也拥有相似的CRBN结合表面？
他们首先利用AlphaFold2预测的人类蛋白质组建立结构数据库。
23,391个人类蛋白最终被拆分为75,684个蛋白结构域，随后使用基于蛋白表面几何和化学特征的MaSIF-mimicry进行搜索。
这里的关键词是“表面”。
研究人员不再简单寻找“序列像不像”“整体折叠像不像”，而是寻找局部相互作用界面是否具有相似的形状和理化特征。
在锌指体系的回顾性测试中，Ikaros、SALL4、WIZ等已知CRBN底物虽然序列差异明显，却表现出较高的表面相似度。相比之下，单纯依赖序列相似性、蛋白语言模型嵌入距离或者整体结构相似性的区分效果明显更弱。
随后，搜索被扩展到整个人类蛋白质组。
以Ikaros的CRBN结合表面为模板，MaSIF-mimicry首先找到了7,480个具有相似表面的蛋白结构域候选者。经过结构稳定性、亚细胞特征等过滤后，研究人员选择排名最高的1,959个候选结构域，进一步构建“盆景文库（bonsai library）”进行GluePCA实验验证。
结果得到43个新的蛋白构建体和6个已知底物，表现出剂量依赖性的CRBN–pomalidomide结合。
更值得注意的是，其中有9个构建体被预测并不依赖经典G-loop。
这意味着CRBN能够利用的蛋白结构空间，很可能比此前基于某一种降解决定簇所划定的边界更大。
研究人员进一步验证了CHD8、TDRD6、SPART、RNF39和CKAP5等候选者。CHD8、TDRD6、SPART和RNF39还通过了哺乳动物细胞NanoBiT互作实验的正交验证；CKAP5虽然在GluePCA和突变实验中符合预测，但在NanoBiT中没有得到同样的结果，因此目前更适合被看作一个有支持证据、但仍需要进一步确认的候选靶点。
这个差异很重要，因为它提醒我们：计算预测和高通量筛选负责扩大搜索空间，正交实验负责把其中的假阳性逐步压下去。
从“发现一个弱结合蛋白”到“找到能让它降解的分子”，RNF39走完了关键一步
发现一个新的CRBN结合蛋白，并不等于发现了一种药物。
因此，研究人员选择此前并不知道是CRBN靶点的RNF39，进一步测试这套方法能否导向新的分子胶化合物。
他们使用NanoBiT筛选了960种免疫调节药物类似物。
该研究报告约0.85%的化合物使RNF39–CRBN结合比pomalidomide提高至少2倍，并最终得到8个明显增强相互作用的化合物。
8个命中化合物中，Z5000181945和Z4999952733表现最强，诱导的RNF39–CRBN结合均约为pomalidomide的5倍。
其中Z5000181945在约1 μM时达到接近饱和的互作水平。RNF39关键界面的G135N突变则几乎消除了这种药物诱导结合，与MaSIF-mimicry预测的结合模式一致。
更关键的一步随后出现：10 μM Z5000181945处理20小时能够降低RNF39 RING finger结构域的蛋白水平，而加入1 μM NEDD8激活酶抑制剂MLN4924后，这种下降被挽救。
这说明，从“计算预测一个弱CRBN结合表面”，到“实验确认结合”，再到“药化筛选增强结合”，最后到“产生CRBN通路依赖的蛋白降解”，这条路线至少在RNF39结构域上完成了一个概念验证闭环。
但别急着把43个新结合者理解成43个新药物靶点
这项工作的意义很大，但它的局限性同样需要看清。
首先，GluePCA是在酵母中过表达蛋白构建体进行的高通量结合实验。它非常适合发现潜在相互作用，却不能完全模拟人类细胞中天然蛋白的表达水平、亚细胞定位和竞争环境。
其次，为了进行大规模筛选，MaSIF候选蛋白中很多被截短成约86个氨基酸左右的“bonsai”结构域。该研究也明确把这一体系定位为一种粗筛（coarse pre-screen）。一个截短片段能够结合CRBN，并不自动意味着全长蛋白（full-length protein）在天然构象中同样能够接近CRBN。
第三，结合不等于降解。 |
降解还需要合适的三元复合物构象、有效的泛素转移以及完整的细胞环境。本文最重要的观点恰恰不是“这些蛋白都会被降解”，而是“这些蛋白已经站在一个可能被药物化利用的起点上”。
第四，RNF39目前证明的是其RING finger结构域可以被Z5000181945诱导降解，而不是已经证明内源性全长RNF39能够在疾病模型中被有效、选择性地清除，更没有直接回答药效、安全窗和体内药代动力学问题。
所以，把这篇论文解读为“发现了几十个新降解药物靶点”会走得太远。
更准确的说法是：研究人员绘制了一张此前缺失的“弱结合地图”。
“不可成药”的边界，或许可以从“有没有口袋”转向“能不能形成可优化的界面”
传统小分子药物发现往往先问：这个蛋白有没有一个适合小分子进入的结合口袋？
分子胶提供了另一种可能。
如果一个蛋白表面已经能够以较弱的方式接近CRBN，那么药物设计需要解决的就不再完全是“从零创造结合”，而可能是把一个已经存在的弱相互作用推向更稳定、更选择性的三元复合物。
这也是“潜在CRBN互作组”最值得关注的地方。
该研究中的数据展示了一条逐级收敛的路线：8,363个单锌指、5,293个双锌指、75,684个人类蛋白结构域、1,959个优先筛选候选、43个新的CRBN结合蛋白构建体，再到RNF39的8个化合物命中和一个能够诱导结构域降解的分子。
它把过去相当依赖表型筛选和偶然发现的分子胶研究，向“先绘制可结合空间，再进行化学优化”推进了一步。
而接下来更值得追问的，也许不是“还有多少蛋白能被pomalidomide降解”，而是三个更困难的问题：
这些在简化体系中观察到的弱结合，有多少能够在内源性全长蛋白环境中保留下来？
不同蛋白之间高度相似的可结合表面，能否通过药物设计被进一步拉开，从而获得足够的蛋白质组选择性？
如果只需要把某些弱相互作用增强两三倍就可能跨过降解阈值，那么未来的分子胶发现，是否可以从大规模“找降解结果”，逐渐转向系统性地“找可以被优化的起始界面”？
如果答案是肯定的，那么这篇研究提供的就不只是一批新的CRBN结合蛋白。 它更像是在告诉我们：过去那些因为“没有发生降解”而被忽略的弱相互作用，本身可能就是一种尚未被充分利用的药物资源。 |
参考文献