iMetaOmics高引论文 | 云南大学车荣晓组-土壤活体微生物研究方法的比较与评估

不同方法在表征土壤活体原核生物多样性和多度方面的表现差异巨大

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研究论文

● 原文链接:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/imo2.70011

● DOI: https://doi.org/10.1002/imo2.70011

● 2025年3月28日，云南大学大学车荣晓课题组在iMetaOmics在线发表了题为“The performance of different methods in characterizing soil live prokaryotic diversity and abundance is highly variable”的文章。

● 本研究系统比较和评估了碱性缓冲液洗涤、叠氮溴化丙锭（PMA）处理、DNase预消化、rRNA直接表征等常用的活体土壤微生物研究方法。综合考虑多方面因素，推荐使用DNase预消化法进行土壤活体微生物研究。

●  第一作者：杜远

●  通讯作者：车荣晓（cherongxiao@ynu.edu.cn）

●  合作作者：王泽霖、刘开放、柴官煜、池源、李婷、段毅、夏天娇、刘冬

●  主要单位：云南大学国际河流与生态安全研究院、云南省水土流失防治与绿色发展重点实验室、西南跨境生态安全教育部重点实验室、植被结构功能与建造全国重点实验室

●  去除胞外DNA（eDNA）对土壤原核生物的多度和多样性分析产生了显著影响，但其对群落构建机制分析的影响通常可以忽略不计;

●  基于不同活体原核生物研究方法所表征的微生物多度、丰富度和群落结构表现出很大的差异;

●  各方法在去除eDNA和描述土壤活体原核生物群落特征方面的表现差异很大，其中DNASE预消化消化法的效果最佳；

●  rRNA直接表征法同样具有突出的应用潜力，但有关土壤胞外rRNA的留存时间和细胞rRNA含量生态意义的认识空缺限制了其应用。

引  言

土壤微生物作为生物地球化学循环的核心驱动者，在维持生态系统功能与健康中发挥关键作用。当前的研究主要依赖于扩增子测序、宏基因组分析、基因芯片和定量PCR等技术。值得注意的是，源于裂解微生物的细胞外DNA可在土壤中持续存在数周至数年，占土壤总DNA库的近40%。其存在的时间受温度、湿度、pH和有机质等环境因子调控：低温与高有机质含量能够延缓降解，而高温高湿的环境则会加速分解。然而现行微生物分析多基于总DNA提取，其结果可能受胞外DNA的干扰。因此，消除胞外DNA的潜在影响成为当前土壤微生物组学研究的重要挑战。

为应对这一挑战，研究人员开发了一系列方法来研究活体微生物，包括碱性缓冲液洗涤、叠氮溴化丙锭（PMA）处理、DNase预消化和rRNA直接表征等。其中碱性洗涤能有效去除胞外DNA，曾是研究活体微生物最常用的方法。PMA在可见光下与胞外DNA形成不可逆的共价交联，从而抑制后续PCR扩增，而活体细胞凭借完整膜结构可排斥PMA进入，使其DNA得以提取和扩增，近年来PMA处理法在研究土壤活体微生物多度和多样性方面得到了广泛应用。DNase I作为去除胞外DNA的另一种有效方法，主要通过水解磷酸二酯键降解胞外DNA，也常被用于土壤活体微生物组研究。此外，因rRNA在胞内含量高，且在环境中极不稳定，已有学者提出，rRNA表征法也可用于研究活体微生物群落。总之，这些方法原理迥异，可能对活体微生物群落解析产生显著有影响。

事实上，关于胞外DNA对微生物多样性分析的影响，不同方法的研究结论存在矛盾。例如，基于PMA处理的多项研究都观察到胞外DNA显著影响了土壤微生物多样性。相比之下，一项基于DNase预消化法的研究则未观察到胞外DNA对土壤细菌多样性的显著影响。因此，比较和评估解析土壤活体微生物的常用方法是土壤微生物学领域的迫切需要。目前，已有一些研究初步评估了相关方法在研究土壤活体微生物多度和多样性方面的效率。然而，相关研究主要集中于基于纯培养菌株或针对有限数量环境样本的单一方法。目前，尚未有基于大尺度环境样本对土壤活体微生物研究方法进行系统的比较和评估。

因此，本研究基于在中国西部采集的土壤样本，系统地比较和评估了研究活体微生物群落的碱性缓冲液洗涤法、PMA处理法、DNase预消化法和rRNA直接表征法等4种常用方法。样点的海拔、年均温和年均降水量范围分别为21~4618 m、-6.04~21.83℃和40.7~1565.1 mm。测定并比较了基于不同方法所表征土壤原核生物的多度、多样性、共现模式和群落构建机制。此外，还通过标签DNA添加实验评估了各方法的胞外DNA去除效率，并采用模拟群落验证了各方法在表征活体群落方面的可靠性。本研究重点验证了“不同方法在表征活体原核生物多度与多样性方面存在显著差异”这一核心假设。

结  果

不同核酸提取方法对土壤原核生物多度与多样性的影响

与总DNA提取相比，DNase预消化和PMA处理均显著降低了土壤原核生物丰度，而碱性缓冲液洗涤和rRNA直接表征则没有观察到显著差异（图1A）。核酸提取方法对土壤原核生物丰富度和香农指数的分析也有显著影响（图1B、C）。具体而言，与总DNA提取相比，DNase预消化导致原核生物丰富度显著下降了5.6%，而rRNA直接表征平均提高7.6%的扩增子序列变异（ASV）数（图1B）。尽管如此，与总DNA提取相比，碱性缓冲液洗涤和PMA处理未对原核生物丰富度产生显著影响（图1B）。不同核酸提取方法所表征的原核生物香农指数与丰富度的响应相似，但灵敏度更高（图1C）。除了总原核生物和活体原核生物之间的区别之外，在各个胞内核酸提取方法间，也观察到了活体原核生物多度和多样性的显著差异（图1A-C）。

图1. 不同核酸提取方法对土壤原核生物16S rRNA基因拷贝数、丰富度和香农指数的影响

（A）16S rRNA基因拷贝数/克土壤（log10）；（B）原核生物物种丰富度（103）；（C）原核生物香农指数。Total：总DNA提取；DNase：DNase预消化；ABW：碱性缓冲液洗涤；PMA：叠氮溴化丙锭（PMA）处理；rRNA：rRNA直接表征。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001。

不同方法所表征土壤原核生物群落结构的差异

五种核酸提取方法共检测到62,939个共有ASV（占全部ASV的67.8%），共有ASV的平均相对多度为97.6%（图S1）。然而，不同方法所表征的多个原核生物类群的相对多度表现出显著差异（表S1；图2A–F及S2–6）。例如，与碱性缓冲液洗涤相比，DNase预消化显著降低了放线菌门的相对多度（图2A）。进一步分析表明，总体与活体原核生物的群落结构相似性仅约50%，其中碱性缓冲液洗涤法的相似性最高，而rRNA直接表征最低（图S5）。此外，活体原核生物群落间的结构相似性为47.8%~66.2%（图S5）。总体与活体原核生物群落的相似性与多个环境因子显著相关，但其相关性的强度和性质因方法而异（图S7）。具体而言，基于DNase预消化法与总DNA提取所表征群落结构的相似性与土壤水分、总磷、总氮、总有机碳及黏粒含量呈显著负相关，而与砂粒含量呈正相关（图S7）；rRNA直接表征与总DNA提取所表征群落结构的相似性与土壤总磷、总钾及总有机碳含量呈正相关，而碱性缓冲液洗涤和PMA处理所表征群落结构的相似性与环境因子相关性较弱（图S7）。

图2. 不同土壤活体微生物研究方法所表征土壤原核生物类群的相对多度差异

（A）DNase与ABW的比较；（B）DNase与PMA的比较；（C）DNase与rRNA的比较；（D）ABW与PMA的比较；（E）ABW与rRNA的比较；（F）PMA与rRNA的比较。统计比较的详细说明见表S1。DNase：DNase预消化；ABW：碱性缓冲液洗涤；PMA：叠氮溴化丙锭（PMA）处理；rRNA：rRNA直接表征。红色节点表示前者相对多度明显高于后者的类群，绿色节点表示前者相对多度明显低于后者的类群。仅显示差异显著的原核生物类群。从内到外的环代表原核生物从界到属的分类级别。

不同方法所表征的土壤原核生物共现网络

不同方法所表征的土壤原核生物共现网络复杂度具有显著差异（图3A–E）。去除胞外DNA干扰后，网络复杂度显著降低：负连接数减少85.3%~98.5%，网络连通性下降15.6%~63.7%（表S2；图3A–E），但模块化程度提升了9.9%~47.8%（表S2）。总原核生物群落的网络鲁棒性显著低于活体原核生物（图3F），其鲁棒性排序为：rRNA直接表征 > 碱性缓冲液洗涤 > PMA处理 > DNase预消化 > 总DNA提取（图3F）。不同方法的网络模块中心节点（Module hubs）数量与组成差异显著，基于rRNA直接表征的网络模块中心点数量显著高于其他方法（图3A–E），且活体原核生物网络中41.7%~72.7%的模块中心点发生了更替（图S8）。

图3. 基于不同核酸提取方法所表征的土壤原核生物共现模式

（A–E）基于不同核酸提取方法的土壤原核生物群落共现模式；（F）基于不同核酸提取方法的网络鲁棒性。根据分类信息对节点进行了着色，文本中的节点代表模块中心点。网络的鲁棒性是根据从网络中移除的节点比例所引起自然连通性的变化来评估的，自然连通性的下降率越高，表明网络的稳定性越低。Total：总DNA提取；DNase：DNase预消化；ABW：碱性缓冲液洗涤；PMA：叠氮溴化丙锭（PMA）处理；rRNA：rRNA直接表征。

不同方法所表征土壤原核群落构建机制的一致性

不同方法解析的原核生物群落结构与地理距离或环境因素有的关系十分相似（图4A和S9）。具体而言，随着地理距离的增加，原核生物群落结构的相似性显著下降（图4A）。最主要区别是，基于rRNA直接表征的原核生物群落结构相似性的衰减速率远低于其他方法（图4A）。同样，不同核酸提取方法所表征的原核生物群落结构一般与年均温（MAT）、年均降雨量（MAP）、海拔、pH值、总氮（TN）和粉粒含量（图S9和表S3）显示出显著和相似的相关性。为进一步揭示环境因素对不同方法所表征原核生物群落结构的直接和间接影响，我们进行了结构方程模型分析。结果表明，地理位置、气候变量、土壤性质和质地共同解释了原核生物群落结构的大部分变异，不同方法的解释方差略有不同：DNase预消化（74%）、碱性缓冲液洗涤（72%）、PMA处理（69%）、总DNA（69%）和rRNA直接表征（50%）（图S10）。

此外，不同方法所揭示的群落构建机制高度一致（图4A–D）。修正随机比（MST）分析表明，随机过程和确定性过程在决定土壤原核生物群落构建方面几乎同等重要（图4B）。系统发生学（iCAMP）分析表明，同质性选择（HoS）、扩散限制（DL）和漂变是驱动土壤原核生物群落构建的主要过程，其贡献率分别为38.36%~43.5%、28.8%~31.1%和20.38%~24.04%（图4C）。相反，异质选择（HeS）和同质扩散（HD）的贡献几乎可以忽略不计（图4C）。中性模型（NCM）可解释原核生物群落结构中约75%的变异，且不同核酸提取方法所表征原核生物群落的Nm值相似（图4D）。

图4. 基于不同方法的原核生物群落相似性距离衰减模式和构建机制

（A）距离衰减关系；（B）基于修正随机比（MST）的群落构建机制；（C）基于iCAMP的群落构建机制；以及（D）中性群落模型（NCM）的适合度。HoS：同质选择；HeS：异质选择；HD：同质扩散；DL：扩散限制；Total：总DNA提取；DNase：DNase预消化；ABW：碱性缓冲液洗涤；PMA：叠氮溴化丙锭（PMA）处理；rRNA：rRNA直接表征。

不同方法对活体原核群落表征准确性的评估

本研究通过以总DNA提取为对照，确定土壤中活体原核生物的多度和多样性，对不同方法所表征土壤原核生物多度和多样性的准确性进行评估。采用这种方法是因为模拟群落主要由活菌组成，灭菌土壤中的胞外DNA与所添加的胞内DNA相比近乎可以忽略，因此可以认为总DNA提取近似反映了活体原核生物群落。研究发现，DNase预消化和PMA处理均显著低估了16S rRNA基因拷贝数（图5A）。此外，除碱性缓冲液洗涤外，所有方法都会导致活体原核生物群落结构发生显著改变（图5B–D和S11）。例如，PMA处理显著高估了埃希氏菌属（Escherichia）的比例，而低估了芽孢杆菌属（Bacillus）和假单胞菌属（Pseudomonas）的比例（图5C）。DNase预消化显著低估了副球菌属（Paracoccus）的相对多度，而DNA酶消化和rRNA直接表征都显著高估了链霉菌属（Streptomyces）的比例。进一步分析表明，碱性缓冲液洗涤的群落结构解析准确率最高（94.9%），显著优于DNase预消化（87.8%）、PMA处理（85.1%）及rRNA直接表征（82.2%）（图5D）。

此外，本研究还探讨了各个方法所表征原核生物群落与总群落的相似性与环境因子的关系，这用于反映不同方法的准确性。例如，PMA处理所表征的相似性与土壤总钾含量呈正相关，与砂粒含量呈负相关；rRNA直接表征的相似性与G+/G-比率（革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌）呈正相关，与黏粒含量呈负相关。另外，碱性缓冲液洗涤表征的相似性与土壤pH值呈负相关（图S12）。

图5. 不同核酸提取方法所表征的模拟微生物类群的多度和群落结构

（A）土壤16S rRNA基因拷贝数；（B）模拟土壤微生物群落的结构；（C）总微生物和活体微生物类群的相对多度差异，差异通过t检验揭示；（D）总DNA提取和不同土壤活体微生物研究方法所表征模拟群落结构的相似性。Total：总DNA提取；DNase：DNase预消化；ABW：碱性缓冲液洗涤；PMA：叠氮溴化丙锭（PMA）处理；rRNA：rRNA直接表征。

不同方法对土壤胞外DNA的去除效率

所有胞内DNA提取方法都能去除土壤中80%以上的游离标签胞外DNA，但去除效率差异很大（图6和表S4）。其中，DNase预消化法的去除效率最高，在森林土壤和草地土壤中分别达到99.45%（SD = 0.33%， CV = 0.33%）和99.86%（SD = 0.08%，CV = 0.08%）。在森林和草地土壤中，PMA处理的平均去除率也分别达到了91.69%（SD = 10.12%，CV = 11.04%）和88.04%（SD = 19.23%，CV = 23.51%），但森林土壤重复间的变异性较大。在所有评估方法中，碱性缓冲液洗涤法的去除率最低，在森林土壤和草地土壤中的去除率分别为85.84%（SD = 8.80%，CV = 10.24%）和81.94%（SD = 9.23%，CV = 11.44%）。

图6. 基于不同核酸提取方法的标签胞外DNA拷贝数和去除效率

（A）森林生态系统中不同核酸提取方法下标签胞外DNA的拷贝数；（B）森林生态系统中不同核酸提取方法下标签胞外DNA的去除率；（C）草原生态系统中不同核试验提取方法下标签胞外DNA的拷贝数；（D）草原生态系统中不同核酸提取方法下标签胞外DNA的去除率。Total：总DNA提取；DNase：DNase预消化；ABW：碱性缓冲液洗涤；PMA：叠氮溴化丙锭（PMA）处理。

讨  论

总体与活体土壤原核生物群落的差异

本研究发现，除碱性缓冲液洗涤法外，其他胞内DNA提取方法均显著降低了土壤原核生物多度（图1A）。该结果与多项研究一致，表明胞外DNA的存在可能导致原核生物多度的高估。碱性缓冲液洗涤的不一致结果主要归因于其促进微生物细胞裂解的能力。已有研究表明，碱性磷酸盐溶液洗涤可使DNA产量增加24%，从而抵消甚至逆转胞外DNA去除所导致的损失。此外，与其他方法相比，碱性缓冲液洗涤较低的胞外DNA去除效率也可能是导致上述不一致性的原因（图6）。与许多研究相似，我们观察到16S rRNA基因拷贝数显著高于16S rDNA基因拷贝数（图1A）。这种差异源于rRNA与rDNA的内在固有差异，即单个rDNA分子可转录为多个rRNA分子。综上所述，土壤胞外DNA可能导致微生物多度的高估，而DNase预消化和PMA处理可有效缓解这一影响。

与之前的一些研究相反，我们的研究表明，去除胞外DNA并未导致土壤原核生物丰富度的显著下降（图1B）。仅有采用DNase预消化法的分析才观察到显著的多样性减少（图1B），而且在基于总DNA提取所表征的原核生物群落中仅发现了75个特有的ASV（图S1）。这一矛盾主要归因于胞内DNA提取的土壤上样量不同。具体而言，一些研究仅使用0.03 g土壤进行胞内DNA提取，而本研究则使用了0.5 g土壤进行胞内DNA提取。我们最近的研究发现，DNA提取土壤用量不足会导致微生物丰富度被严重低估，这为本研究与之前研究的不一致性提供了合理解释。另一个值得注意的发现是，基于rRNA分析直接表征的土壤原核生物丰富度明显高于基于总DNA提取所表征的丰富度（图1B）。这一差异的部分原因可能是转录错配和提取RNA时使用的土壤用量较高。此外，rRNA直接表征法对稀有物种的检测灵敏度较高，也可能是造成这种差异的原因之一。这些发现表明，胞外DNA对微生物多样性分析的影响在以前的研究中可能被夸大了。

本研究发现，基于胞内DNA和总DNA提取所表征土壤原核生物的群落结构存在显著差异（图S4–S6），与多项研究一致，其主要原因为胞内外rDNA的固有差异，它们分别主要源自存活和死亡的微生物。微生物死亡通常由环境选择与随机过程驱动：环境选择方面，死亡微生物的环境适应能力通常低于活体微生物，从而导致死亡和存活微生物之间出现不同的群落结构；随机死亡虽与种群大小相关，但不同类群的随机死亡率差异仍可导致群落差异。此外，由于序列差异会影响胞外DNA的降解机率及其与土壤矿物质的吸附，胞外DNA的降解可能具有高度类群特异性，进一步加剧了胞内/外DNA所表征群落结构的差异。同时，rRNA和rDNA所表征的群落结构差异显著（图S6D），这一现象已被广泛报道，主要源于rRNA与rDNA的生态意义差异。由此可见，胞外DNA对微生物群落分析的影响需谨慎评估。

胞外DNA的去除显著简化了土壤原核生物的共现网络，但增强了网络鲁棒性（图3及表S2）。网络复杂度的降低主要源于群落多样性下降（图1），并且胞外DNA携带的历史生态足迹信息会增加网络的冗余连接。鲁棒性增强则可能与网络的模块化程度提高有关（表S2），同时网络内关键类群的变化也可能进一步影响鲁棒性。这些结果表明，基于总DNA提取的微生物分析高估了网络的复杂性，且低估了网络的鲁棒性。有趣的是，不同核酸提取方法所表征的土壤原核生物群落在构建机制上显示出高度的一致性（图4和S9）。因此，在大尺度土壤原核生物群落构建机制分析中，胞外DNA的影响可以忽略不计。

不同方法所表征活体原核生物群落的差异

与假说一致，本研究发现，不同方法所表征的土壤活体原核生物多度和多样性存在显著差异（图1、2和表S1）。这些差异主要归因于各方法胞外DNA去除效率和胞内DNA提取效率的差异（图5和图6）。例如，碱性缓冲液洗涤法的胞外DNA去除效率显著低于DNase预消化法（图6）。此外，各方法对不同原核生物类群的提取效率差异极大。例如，在大尺度比较实验和模拟群落实验中，PMA处理下芽孢杆菌属的相对多度均显著低于碱性缓冲液洗涤法（图2D和5C）。除此之外，如前所述，细胞rDNA和rRNA的含量具有不同的生态学意义。这可能是基于rRNA和胞内rDNA方法观察到的原核生物多度和多样性存在差异的主要原因。鉴于这些不一致性，在研究活体原核生物群落时必须考虑不同方法的可靠性。

土壤质地与有机质含量是核酸提取效率的关键影响因素。例如，有机质含量高的土壤会增加提取液的黏度，从而可能阻碍细胞的有效裂解和核酸回收（图S7）；有机质还会干扰DNase活性，降低胞外DNA去除效率。土壤矿物与黏粒可能吸附核酸酶导致失活，降低其生物降解效率，这解释了DNase预消化法所表征群落与总群落的相似性与总有机碳（TOC）及黏粒含量的负相关（图S7）。粘土含量高或颗粒细小的土壤可能对胞外DNA有更强的吸附力，从而降低了DNA的可提取性（图S12）。这些因素可能导致不同类型土壤的提取效率存在显著差异，从而影响不同研究结果的可比性。

碱性缓冲液洗涤法又称顺序提取法，是同时提取胞内和胞外DNA最广泛使用的方法。本研究发现，该方法最大程度地减少了提取过程对活体原核生物群落结构解析的干扰（图5），但其去除胞外DNA的效果并不理想（图6）。事实上，多项研究指出，使用这种方法获得的胞外DNA比例远低于目前可接受的范围。值得注意的是，胞外DNA去除方法的效率会因土壤类型和环境条件的不同而有很大差异。例如，碱性缓冲液洗涤法在低pH土壤中效果较差，可能会导致胞外DNA的残留（图S12），会影响此类环境中微生物群落分析的准确性。因此，尽管碱性缓冲液洗涤法对胞内DNA提取干扰较小，但其胞外DNA去除效率低的问题限制了在活体微生物研究中的应用。

PMA处理法在去除胞外DNA与提取胞内DNA方面效率较高（图5D及6），但其稳定性较差，即使是针对同一样本的技术重复（图5D及6）。此外，一些研究还强调了这种方法的不确定性。首先，对某些物种而言，PMA穿透其死亡微生物的细胞壁和细胞膜是个挑战。例如，死亡M.avium较厚的细胞壁和霉菌酸会在很大程度上阻止了PMA的穿透。其次，透光是PMA反应的必要条件，因此土壤浊液的高浊度会严重影响PMA反应。此外，一些研究使用极少量的土壤提取DNA来解决这一问题，但这可能会因土壤用量不足而导致微生物丰富度被低估。最重要的是，一些研究发现PMA处理在反映复杂活体微生物群落方面存在严重的局限性。与碱性缓冲液洗涤法类似，PMA处理的效率也可能不稳定，尤其是在微生物群落复杂或土壤性质多变的土壤中（图S12）。因此，尽管PMA处理法是目前研究活体微生物最广泛使用的方法，但在解释基于该方法的结果时必须谨慎。我们建议针对特定的土壤类型进一步优化该方法，以提高其在实际应用中的可靠性和有效性。

在本研究中，DNase预消化法去除胞外DNA的效率最高，且对活体群落的表征准确性也可以接受（图5和图6）。该方法试剂成本低，培养时间短，对高通量测序过程的影响微乎其微，因此是一种有效且适合大尺度研究的方法。综上所述，我们推荐使用DNase预消化法提取土壤微生物胞内DNA，这是一种前景广阔、经济有效的方法。这些发现提供了宝贵的见解，可以推广到水生或沉积物等其他环境，并为提高不同生态系统微生物群落分析的准确性和可靠性奠定基础。

目前，所有基于胞内DNA提取的方法均严重依赖于新鲜土壤。然而，微生物群落通常无法在鲜土中长期保持稳定，因此这些方法不适合时间跨度长和缺乏实时DNA提取条件的研究。幸运的是，rRNA直接表征法为解决这些难题提供了一种很有前景的选择。然而，其应用目前受到两个主要认知空缺。首先，土壤胞外rRNA的快速降解是使用这种方法研究活体微生物的必要前提。然而，土壤胞外rRNA的降解速率及其影响因素仍有待探索。其次，如上所述，基于rRNA直接表征的土壤微生物多度、多样性和群落结构与基于DNA的研究结果相比存在显著差异（图1、2和S6D）。然而，细胞rRNA含量的生态学影响仍存在很大争议。因此，未来的研究工作应优先解决这些问题。

尽管本研究结果提供了有价值的见解，但需要认识到可能影响研究结论的实验误差来源。这些误差来源包括样品处理、DNA提取和测序过程，每个环节都可能引入变异。例如，样本采集过程中的污染、DNA提取操作不当，或测序误差均可能影响结果的准确性。此外，针对每种土壤类型的各方法仅分析了一个重复样本，这限制了我们评估每种处理方法重复性的能力。在单一采样点进行重复取样将有助于解决这一局限性，并更清晰地揭示方法变异性。这些误差来源是任何涉及复杂生物样本的研究都固有的，在解释研究结果时应加以考虑。

结  论 

本研究表明，胞外DNA显著影响了土壤原核生物多度、多样性、群落结构与共现网络分析，但对群落构建机制的影响几乎可以忽略不计。我们还观察到，不同方法所表征的土壤活体原核生物多度、丰富度、群落结构和共现模式差异很大。进一步的评估表明，碱性缓冲液洗涤可最大限度地减少提取过程对活体原核生物群落结构的影响，但其去除胞外DNA的效果较差，因此不建议使用。DNase预消化和PMA处理在去除土壤胞外DNA方面表现出很高的效率，其中DNase预消化在表征活体原核生物群落上表现出最高的整体效率和稳定性。虽然rRNA直接表征有望用于土壤活体微生物的研究，但目前对土壤微生物胞外rRNA降解速率和细胞rRNA含量的生态学意义的认知空缺，阻碍了其应用。总之，本研究系统地比较和评估了研究土壤活体微生物的常用方法，为优化土壤微生物组研究方法提供了重要依据。

方  法

研究地点与土壤采样

土壤样本采集自中国西部的52个地点，涵盖云南、四川、西藏、青海和新疆等多个省份（图S13）。研究区域包括多种生态系统类型，如高寒草甸、高寒草原、沙漠、灌木丛、杉木林、针叶林和农田（表S5）。研究区域的气候和地形也具有高度异质性，采样点的海拔、年均温（MAT）和年均降水量（MAP）分别为421~4618 m、-6.04~21.83 ℃和40.7~1565.1 mm。这种高度异质性确保了本研究结果的普适性。此外，大部分研究地点的气候干燥和寒冷，凸显了胞外DNA在影响土壤活体原核生物群落分析中的重要性。

在每个研究地点，记录了包括生态系统类型、优势植物、地理坐标、海拔和坡度在内的基本信息，并拍摄了采样点周围环境的照片。随后，随机选择5个子采样点，最小间隔距离为10 m。采集每个点0~10 cm的土壤样本，充分混合后，通过2 mm筛网。用于总DNA和胞内DNA提取，以及无机氮、水分含量测定的土壤样本保存在4℃的冰箱中。用于RNA提取的土壤则保存在液氮中。此外，另一份子样本风干后用于测定pH值及总有机碳、总氮、总磷、总钾和有效磷的含量。每个采样点的MAT和MAP数据来自WorldClim数据库（https://www.worldclim.org）。土壤类型基于联合国粮农组织和维也纳国际应用系统分析研究所建立的世界土壤数据库HWSD2.0提取。采样点的详细描述见表S5和S6。

土壤理化性质分析

土壤含水量的测定方法是将10 g土壤在105℃下烘干。使用pH计测定每个样本的pH值，土壤与去离子水的混合比例为1:2.5。土壤总有机碳含量使用自动元素分析仪（Vario TOC cube, Elementar, Germany）测定。土壤总氮含量使用自动凯氏定氮仪测定（NA1500，Fisons Instruments, Milano, Italy）。土壤总磷含量采用钼锑比色法测定。土壤总钾含量使用火焰光度法测定。土壤中的铵态氮和硝态氮浓度使用2 M KCl溶液浸提，土壤与溶液的比例为1:5。随后，分别使用靛酚蓝法和氯化钒分光光度法测定KCl提取液中的铵态氮和硝态氮浓度。碱性和酸性土壤中的有效磷含量分别采用Olsen法和Bray法测定。土壤质地使用激光粒度分析仪（LS-909, OMEC Instruments Co.,Ltd）测定。根据先前研究提出的标准，土壤颗粒分为黏粒（0~2 µm）、粉粒（2~50 µm）和砂粒（50~2000 µm）。

土壤核酸提取

使用DNeasy PowerSoil Pro试剂盒（Qiagen, Hilden, Germany）从0.50 g鲜土中提取总DNA。此外，分别使用碱性缓冲液洗涤、DNA酶消化和PMA处理提取土壤胞内DNA。除DNA外，使用RNeasy PowerSoil Total RNA试剂盒（Qiagen, Hilden, Germany）提取总RNA。我们使用总DNA作为参考，评估不同方法对土壤胞外和胞内DNA多样性分析的影响。

碱性缓冲液洗涤方法按照已有方法进行。简而言之，将500 µL PBS缓冲液（0.12 M；pH 7.4）和0.50 g新鲜土壤加入微量离心管中，水平摇动30 min（100 rpm）。随后，将悬浊液在7500 × g下离心30 min（4℃），弃上清。重复此过程两次后，使用DNeasy Power Soil Pro试剂盒提取残留土壤中的胞内DNA。

PMA处理按照已有的方法进行，并稍作修改。PMA染料的浓度和处理时间基于先前研究优化，以确保有效去除胞外DNA。具体而言，PMA溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，溶剂体积为500 µL，最终PMA浓度为40 µM。将该溶液加入0.50 g新鲜土壤中，混合物在室温下避光孵育5 min，并轻轻旋转。随后，将试管水平放置在冰盒上，并使用悬挂的650 W卤素灯在距离试管20 cm处进行四次连续的光暗循环，每次30 s。此后，将试管在10,000 × g下离心2 min，弃上清。最后，使用DNeasy Power Soil Pro试剂盒从残留土壤中提取胞内DNA。

DNase预消化法按照最近研究的描述进行。反应混合物包括80 µL DNase I（Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA）、805 µL无核酸酶水、10 µL MgCl₂（1 M）、5 µL牛血清白蛋白（10 mg/mL）、100 µL Tris-HCl（0.5 M；pH = 7.5）和0.50 g新鲜土壤。将试管在37℃下水平孵育60 min，摇动速度为100 rpm。随后，向每管加入50 µL 0.5 M EDTA，并在75°C下孵育10 min以终止DNase反应。之后，将试管在12,000 × g下离心20 min，弃去上清液。最后，使用DNeasy Power Soil Pro试剂盒提取残留土壤中的胞内DNA。

使用RNeasy Power Soil Total RNA试剂盒从2.0 g冷冻土壤中提取RNA，通过加入1 µL DNase I（Qiagen, Hilden, Germany, 10 U）、10 µL 10×DNase Buffer去除90 µL RNA提取物中的DNA残留。反应在37°C下孵育30 min以确保有效去除DNA。随后以总RNA作为模板，使用PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara BioInc., Shiga, Japan）合成cDNA。反应体系包括16 µL模板RNA、2 µL dNTP Mixture（10 mM）和2 µL随机六聚体（50 µM）。在65°C下孵育5 min后，迅速冷却至冰上。随后，向反应体系中加入8 µL 5×PrimeScript II Buffer、1 µL RNase Inhibitor（40 U/µL）、2 µL PrimeScript I RTase（200 U/µL）和9 µL无RNase水。最后，反应体系在30°C下孵育10 min，随后在42°C下孵育60 min，并在95°C下终止5 min。

qPCR和高通量测序

为定量原核生物16S rRNA基因拷贝数，我们使用LightCycler96实时PCR系统（Roche, Germany），使用的通用引物为515F（5′-GTG NCA GCM GCC GCG GTA A-3′）和806R（5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′）。在进行高通量测序时，使用相同的通用引物扩增16S rRNA基因。在土壤微生物群落分析中，最低序列数为50,000，而在模拟群落实验中，测序深度为35,000。所有详细的PCR条件和生物信息学分析程序见补充材料的方法部分。

土壤原核生物共现模式分析

原核生物共现网络分析仅包括出现频率高于50%（至少在一半样本中出现）且平均相对多度大于0.01%的ASV。选择此阈值是为了将分析重点放在采样中代表性较好的微生物类群上。使用R包WGCNA构建Spearman相关性矩阵，相关系数阈值为0.80，FDR调整后的p值 < 0.05，以保留共现网络分析中微生物类群之间的强相关性。使用“igraph”包计算网络属性，并使用Gephi进行可视化。通过计算自然连通性在移除不同比例节点时的变化来评估网络的鲁棒性。网络分析方法的详细描述，包括节点分类和生态学解释，见补充方法。

土壤原核生物群落构建机制分析

在本研究中，我们分别使用中性群落模型（NCM）、修正随机性比率（MST）和iCAMP模型来量化基于不同方法的土壤群落构建机制。更多方法细节见补充材料方法部分。

基于不同方法的土壤活体原核生物多度和多样性分析准确性评估

从上述52个土壤样本中选择了8个典型土壤，评估不同方法对土壤活体原核生物多度和多样性分析的准确性（图S14b）。这些土壤通过在121℃下高压灭菌30 min，随后在室温下孵育24 h进行灭菌。此过程重复三次以确保彻底灭菌。我们构建了一个由大肠杆菌Escherichia coli（革兰氏阴性，快速生长）、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens（革兰氏阴性，多功能）、脱氮副球菌Paracoccus denitrificans（革兰氏阴性，反硝化）、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis（革兰氏阳性，产孢子）和吸水链霉菌Paracoccus denitrificans（革兰氏阳性，丝状）组成的模拟群落，所有菌株均购自BNCC（BeNa Culture Collection）。这些菌株的详细信息见表S7。将模拟群落接种到每份灭菌土壤中，并立即提取总DNA、胞内DNA和RNA，具体操作如补充方法所述。我们使用总DNA作为活体原核生物群落的参考，因为模拟群落由活菌组成。灭菌土壤中可忽略的胞外DNA进一步支持总DNA作为活体原核生物群落的可靠标记。随后，进行qPCR和高通量测序，以分别测定土壤原核生物的多度和多样性，具体如补充方法所述。鉴于接种菌株的序列在所有研究地点中占96%以上，我们随后的分析仅关注这5个菌株。

基于不同方法的土壤细胞外DNA去除效率测定

本研究选择了一份草地土壤和一份森林土壤，进一步评估了不同方法对土壤胞外DNA的去除效率（图S14c）。使用带标签引物的的16S rDNA模拟胞外DNA。简而言之，在标签引物在515F的5′端添加了19bp的人肌动蛋白序列（5′-CAT TGG CAA TGA GCG GTT C-3′）。以从土壤样本中提取的DNA为模板，使用ACTF-515F和806R生成ACTF标记的16S rDNA PCR产物。PCR体系和参数如补充方法中的描述相同。使用GeneJET凝胶提取试剂盒（Thermo Scientific, Lithuania）纯化PCR产物，并使用Nanodrop2000（NanoDrop Technologies, USA）定量。随后，将ACTF标记的16S rDNA扩增子（源自每个土壤样本）以相当于该土壤总DNA含量50%的浓度添加到相应土壤中。立即提取总DNA和胞内DNA，如前所述，每个样本四个重复。然后使用ACTF和806R通过qPCR测定DNA提取物中的ACTF-16S rDNA拷贝数。在原始土壤所提取的DNA中，基于ACTF和806R未观察到阳性扩增，这很大程度上确保了该方法的可靠性。最终，DNA去除效率计算为胞内DNA中ACTF标记的16S rDNA拷贝数与总DNA中ACTF标记的16S rDNA拷贝数的比值。在本部分实验中，同样选择总DNA作为参考，因为它可以提取添加到土壤中的所有被标记的胞外DNA，为比较不同方法去除胞外DNA的有效性提供了基准。

统计分析

本研究使用重复测量方差分析（RMANOVA）确定不同研究方法对土壤原核生物多度和多样性分析的影响。使用Venn Diagram和UpSet R包识别和可视化了不同核酸提取方法表征的原核生物群落在ASV水平上共有和特有的ASV数量。使用非度量多维标度（NMDS）、主坐标分析（PCoA）和置换多元方差分析（PERMANOVA）评估了不同研究方法对土壤原核生物群落结构的影响。使用Wilcoxon符号秩和检验确定不同活体原核生物研究方法对原核生物类群相对多度的影响，并使用Graphlan（http://gephi.github.io/）进一步可视化。类似方法也用于评估不同方法下活体和总体原核生物群落结构的差异。此外，计算了配对Bray-Curtis距离以进行进一步分析。使用geosphere包中的“distm”函数计算每对采样点之间的地理距离，然后基于Mantel检验分析了地理距离与群落组成相似性之间的关系。使用Mantel检验计算环境因素与原核生物群落结构之间的关系。使用结构方程模型探索环境因素与微生物群落之间的潜在因果关系。方法细节见补充材料方法部分。大多数统计分析在R（4.3.2）中进行。

代码和数据可用性

本研究的所有原始数据均已存入美国国家生物信息局（NCBI）的SRA数据库，并在生物项目PRJNA1137527（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA1137527）下公开发布。原始数据的生物样本登录号为SAMN42187461–SAMN42187760、SAMN42464043–SAMN42464053和SAMN42488059。本研究使用的R代码可从GitHub存储库https://github.com/Zoey0526/Soil-live-prokaryotic-community获取。补充材料（方法、图、表、图解摘要、幻灯片、视频、中文翻译版和更新材料）可在在线DOI或iMetaSciencehttp://www.imeta.science/imetaomics/中获取。

引文格式：

Yuan Du, Zelin Wang, Kaifang Liu, Guanyu Chai, Yuan Chi, Ting Li, Yi Duan, et al. 2025. “The performance of different methods in characterizing soil live prokaryotic diversity and abundance is highly variable.” iMetaOmics 2: e70011. https://doi.org/10.1002/imo2.70011.

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5卷1期

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