不是所有免疫细胞聚集，都算得上“战斗据点”
研究人员首先用空间转录组（spatial transcriptomics, ST）分析了来自255名患者的340个肿瘤样本，覆盖12种癌症类型，并在这些组织切片中识别出695个TLS。这个规模让研究人员第一次能从泛癌视角观察TLS的差异。
结果显示，TLS在不同癌种中的分布差异很大。肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）、肾透明细胞癌（kidney renal clear cell carcinoma, KIRC）、胃腺癌（stomach adenocarcinoma, STAD）、乳腺癌（breast cancer, BRCA）、肝细胞癌（liver hepatocellular carcinoma, LIHC）和膀胱癌（bladder carcinoma, BLCA）中更常见；而胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma, PAAD）、口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）、卵巢癌（ovarian carcinoma, OVCA）和胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme, GBM）中较少或几乎检测不到。尤其值得注意的是，在36个GBM样本中没有检测到TLS；研究人员也谨慎指出，这可能与样本数量和空间转录组采样深度有关，而不能直接推断GBM中绝不会形成TLS。
TLS的位置也并不随机。695个TLS中，214个位于肿瘤内部，被定义为肿瘤内TLS（intratumoral TLS, IT-TLS）；231个位于肿瘤边缘附近，被定义为肿瘤周TLS（peritumoral TLS, PT-TLS）；250个距离肿瘤区域更远，被定义为远肿瘤TLS（distal-tumoral TLS, DT-TLS）。三类位置数量大致接近，但不同癌种偏好不同：LUAD和CSCC更容易出现IT-TLS，BRCA更偏向PT-TLS，而LIHC、CRC、BLCA、KIRC和PAAD则更常出现DT-TLS。
这意味着，TLS不是肿瘤组织中均匀撒开的免疫“装饰”。它们有位置偏好，而位置本身可能决定它们与肿瘤细胞的互动方式。
TLS也有“成长阶段”：早期、滤泡样、带生发中心
如果只问“有没有TLS”，会忽略一个更关键的问题：这个TLS成熟了吗？
研究人员将TLS分为三类：早期TLS（early TLS, E-TLS）、原发滤泡样TLS（primary follicle-like TLS, P-TLS）和继发滤泡样TLS（secondary follicle-like TLS, S-TLS）。分类依据包括滤泡树突状细胞（follicular dendritic cells, FDCs）标志物，以及生发中心（germinal center, GC）B细胞相关标志物。
在695个TLS中，E-TLS有379个，占54.5%；P-TLS有215个，占31%；S-TLS有101个，占14.5%。换句话说，真正进入高度组织化成熟阶段的S-TLS只占少数。
三类TLS的差异并不只是形态学上的。E-TLS更像早期淋巴细胞聚集，还没有形成清晰的滤泡结构；P-TLS已经出现B细胞和T细胞区域分离，并有FDC网络，但尚未形成完整生发中心；S-TLS则具备组织化的B/T细胞分区、FDC网络和局部生发中心。随着TLS从E-TLS走向S-TLS，TLS特征评分逐步升高，T细胞、B细胞、FDC标志物，以及BCL6、MKI67等生发中心B细胞相关标志物也同步增强。
更有意思的是，TLS越成熟，往往越大。S-TLS的面积显著大于P-TLS和E-TLS。不同癌种也有不同的TLS成熟偏好：S-TLS在胃腺癌中更富集，P-TLS在肝细胞癌和结直肠癌中更富集，而E-TLS在乳腺癌和卵巢癌中更富集。
这提醒我们：TLS并不是一个静态结构，而是一个可能处于不同发育阶段的免疫生态位。
成熟TLS里，免疫反应和免疫刹车同时出现
如果把S-TLS简单理解成“免疫越强越好”，仍然不够准确。研究人员发现，TLS成熟伴随着一整套细胞和信号网络的重塑。
在B细胞层面，P-TLS中BANK1、CD40等B细胞活化与早期分化相关基因升高，同时出现IGHA1、IGHG1、MZB1、JCHAIN等浆细胞（plasma cell, PC）相关信号。S-TLS中，生发中心B细胞、记忆B细胞和浆细胞分化程序进一步增强，包括PRDM1、XBP1、SDC1和CD38等基因，提示抗体产生和类别转换更加活跃。
研究人员还用多重免疫荧光观察肾透明细胞癌中的抗体分泌细胞（antibody-secreting cells, ASCs）。在E-TLS中，ASC数量少，主要局限在TLS边界内，并以IgG阳性细胞为主；而在P-TLS和S-TLS中，ASC密度增加，IgG阳性和IgA阳性细胞常混杂在滤泡区域，并扩散到TLS周围和邻近肿瘤区域。这为“TLS成熟与抗体输出相关”提供了空间层面的证据。
但成熟TLS并非只有激活信号。S-TLS中，IL10、TGFB1、CD24、CD5、CD1D等调节性B细胞（regulatory B cell, Breg）相关基因达到高峰。Xenium Prime 5K空间转录组进一步显示，一类共表达IL10和CD24或CD1D的Breg样细胞在S-TLS内富集。与此同时，S-TLS中也出现FOXP3、IL2RA、PDCD1、CTLA4、TIGIT、LAG3、HAVCR2等调节性T细胞、免疫检查点和耗竭相关程序。
这不是矛盾，而是免疫组织化的真实样子：激活和制动常常同时存在。成熟TLS可能既能支持局部抗肿瘤免疫，也会启动免疫稳态和限制炎症过度扩张的机制。
离TLS越近，肿瘤细胞越“不一样”
这项研究最有空间生物学味道的发现，来自TLS周围的“距离梯度”。
研究人员以肿瘤内TLS为中心，分析周围肿瘤区域的通路活性如何随距离改变。结果出现两类相反梯度：免疫相关通路在TLS附近最高，离TLS越远逐渐下降；肿瘤内在的增殖和侵袭程序则在TLS附近较低，离TLS越远逐渐升高。
具体来说，干扰素α反应（IFN-α response）、干扰素γ反应（IFN-γ response）、主要组织相容性复合体II类抗原呈递（MHC class II antigen presentation）和炎症信号在TLS邻近肿瘤区域更强；而MYC信号、G2/M细胞周期检查点（G2/M checkpoint）、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）和KRAS信号在远离TLS的肿瘤区域更高。
研究人员还比较了TLS核心与其外侧50微米范围内的肿瘤边界。TNFSF14、CXCR3和CXCR6在TLS核心更富集，而TNFRSF14、CXCL10/11、CXCL16则主要定位在紧邻TLS的肿瘤或基质细胞中，并呈现从TLS邻近区域向远端递减的趋势。单细胞和亚细胞分辨率的Xenium数据进一步支持了这种局部配体-受体空间配对。
这里需要谨慎：这些结果证明的是空间相关性，而不是TLS一定直接抑制了肿瘤增殖。一个合理推断是，TLS附近形成了短程细胞因子和趋化因子场，使免疫细胞募集、停留和激活更容易发生；也可能是肿瘤本身的状态先决定了TLS能在哪里形成。因果方向仍需功能扰动实验验证。
让AI从H&E切片里读出TLS成熟度
空间转录组很强，但成本高、样本量有限。真正有转化潜力的问题是：能不能从常规苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin, H&E）全切片图像（whole-slide images, WSIs）中直接识别TLS，并判断其成熟程度？
研究人员构建了一个AI框架，使用3071张WSI，来自10个队列，包括6个TCGA癌种队列和4个独立治疗队列。该流程先用HookNet-TLS检测TLS，再提取和分割TLS图像，最终获得25088个标注TLS；随后用YOLOv8建立两步分类器：先区分E-TLS与成熟TLS（mature TLS, mTLS），再把成熟TLS细分为P-TLS和S-TLS。
训练集来自LUSC、BLCA和KIRC三个TCGA队列，共956张TLS图像，并按80%训练、20%测试划分。分类器表现不低：在BLCA中，E-TLS与mTLS分类准确率为95.1%，P-TLS与S-TLS分类准确率为85.0%；在LUSC中分别为90.0%和95.6%；在KIRC中分别为84.0%和89.5%。
更关键的是跨癌种泛化。研究人员把模型直接用于空间发现队列中的695个TLS图像，并用匹配的空间转录组分类作为参照。模型正确识别了92.3%的E-TLS和90.2%的mTLS，总体准确率91.4%，ROC AUC为0.908；对成熟TLS继续分类时，模型正确识别98.0%的P-TLS和87.5%的S-TLS，总体准确率94.7%，ROC AUC为0.928。这个结果说明，TLS成熟度在H&E图像中确实留下了可被算法捕捉的形态学信息。
真正有预测价值的，也许不是“有没有”，而是“组合比例”
过去很多研究把患者简单分为TLS阳性和阴性，或成熟与不成熟。但这项研究发现，这种做法在六个癌种中并不能稳定区分总生存期（overall survival, OS）。单看TLS有无，或者用一个“主导TLS状态”概括整张切片，都会丢掉肿瘤内部多个TLS状态并存的信息。
研究人员因此提出TLS成熟感知复合评分（maturation-aware composite TLS score）。做法是把每个样本中E-TLS、P-TLS、S-TLS的数量进行log转换和标准化，再用主成分分析（principal component analysis, PCA）提取组成差异，得到一个连续评分。TLS阳性样本按中位数分成C1和C2两组：C1更富集P-TLS和S-TLS，C2以E-TLS为主。
结果很清楚：C1组患者在六个癌种中均显示更好的总生存，并且该评分在调整肿瘤分期后仍具有独立预后价值。换句话说，TLS的“质量”不应只看一个标签，而要看一个肿瘤内部不同成熟状态TLS的组合。
治疗队列也给出类似方向。卵巢透明细胞癌（ovarian clear cell carcinoma, OCCC）免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）队列中，PPP2R1A突变肿瘤有更多P-TLS和S-TLS，治疗前TLS组成也能区分长生存和短生存患者。高等级浆液性卵巢癌（high-grade serous ovarian carcinoma, HGSOC）化疗加抗血管生成治疗队列、乳腺癌新辅助化疗队列，以及HER2阳性乳腺癌抗HER2治疗队列中，治疗响应者也更常出现成熟TLS富集，尤其是P-TLS增加。
这提出了一个值得深入思考的问题：成熟TLS是否不仅预测免疫治疗反应，也反映了一种更广义的“免疫可动员”组织状态？化疗、靶向治疗和抗血管生成治疗并不直接阻断PD-1或CTLA-4，但它们可能通过抗原释放、免疫原性细胞死亡、血管和基质重塑等机制改变肿瘤免疫微环境。成熟TLS或许正是这种组织状态的可见标记之一。
这项研究真正改变的问题
这项研究的价值，不在于给出一个简单口号：TLS越多越好。它恰恰提醒我们，肿瘤免疫并不适合用“多或少”来概括。
一个肿瘤可以有TLS，但多数只是E-TLS；也可以有较少TLS，却包含更成熟、更有组织化的P-TLS或S-TLS。一个TLS可以靠近肿瘤细胞，也可以远离肿瘤核心；它可以伴随强干扰素和抗原呈递信号，也可能同时出现调节性和耗竭程序。空间、成熟度、组成比例，这三者共同决定了TLS在肿瘤免疫图景中的含义。
反过来看这项研究的结论，也能看到它的边界。首先，多数空间转录组数据仍是点位级分辨率，不等同于完整单细胞图谱。其次，一些癌种和分子亚型的样本量有限，例如CRC、LIHC和BLCA中关于KRAS、HBV、MTAP等因素的观察，更多是趋势而非定论。第三，研究主要揭示相关性，尚不能证明诱导某类TLS成熟就一定改善患者结局。最后，TLS是三维结构，而当前分析多来自二维组织切片，未来还需要连续切片和三维空间组学验证。
即便如此，这项工作仍然把TLS研究向前推了一步。它把一个在显微镜下可见的免疫结构，连接到了空间转录组、AI病理和患者分层。未来如果TLS成熟组成评分能在前瞻性临床研究中验证，它可能成为免疫肿瘤学中一个新的空间型生物标志物：不只是告诉我们肿瘤里有没有免疫细胞，而是告诉我们免疫系统是否已经在正确的位置、以相对成熟的方式组织起来。
这也许是TLS最重要的启示：在肿瘤中，免疫反应的力量不仅取决于有哪些细胞，还取决于它们如何排列、如何协作，以及它们离肿瘤细胞有多近。
参考文献