iMetaOmics | 暨大马文军/刘涛组-解析肠道菌群在大气污染物和气象因素与代谢综合征关联中的中介作用

代谢综合征（metabolic syndrome，MetS）已成为重要的公共卫生问题，影响着全球接近四分之一的人口。有研究预测，MetS的患病率将持续上升，到2035年将达到约53%。MetS会增加心血管疾病、2型糖尿病、睡眠呼吸暂停、恶性肿瘤及全因死亡的风险。越来越多的研究表明，除遗传和生活方式因素外，环境因素在MetS的发生发展中也起着重要作用。长期暴露于细颗粒物（PM_2.5）、二氧化氮（NO₂）等大气污染物，以及气象因素（尤其是环境温度），与MetS风险升高密切相关，然而环境因素与MetS之间的生物学机制目前仍未完全阐明。

近年来，肠道菌群作为宿主代谢稳态的重要调节因子受到广泛关注。肠道菌群失调会损害肠道屏障功能，促进慢性低度炎症，并扰乱糖脂代谢，从而参与MetS的发生发展。基于“同一健康肠道菌群”的理念，大气污染物和气象条件等环境因素可能重塑肠道菌群的组成与功能。然而，环境因素引起的肠道菌群变化是否在MetS的发生发展过程中发挥作用仍不清楚。因此，我们提出如下假设：肠道菌群的变化可能是环境暴露增加MetS风险的一个重要生物学机制途径。

本研究基于广东肠道菌群计划（Guangdong Gut Microbiome Project，GGMP）项目，探讨长期暴露于NO₂、PM_2.5和环境温度与MetS之间的关联，并进一步评估肠道菌群在其中可能存在的中介作用。本研究旨在提供基于人群的证据，验证肠道菌群是否为环境暴露与代谢功能障碍的关键生物学机制途径。

与非MetS研究对象相比，MetS患者的各项肠道菌群α多样性指标均较低，包括Shannon指数、系统发育多样性（PD whole tree）、Chao1指数及 observed species指数（所有P值均 < 0.05；图1A）。基于组内平方和的肘部图显示，将研究对象分为4个类型能够较好地反映其潜在的群落结构（图S4）。在统一流形近似与投影（UMAP）降维图中，4个类型呈现出较为清晰的分离，不同类型人群中MetS病例所占比例存在差异。采用拟时序分析对研究对象按照肠道菌群主要变化的轨迹进行排序。结果显示，4个类型沿该轨迹呈现出一定的排列顺序，提示肠道菌群群落组成的变化与代谢状态差异之间存在关联（图1B）。为识别与肠道菌群分型差异相关的关键菌属，我们比较了各类型中属水平的丰度特征。结果显示，类型1主要富集 Bacteroides 和 Parabacteroides，类型2主要富集 Prevotella 和 Desulfovibrio。类型3分散富集了多个环境相关菌属或机会致病菌属，未见单一优势菌属明显占主导地位，其 centered log-ratio差值（ΔCLR）均小于1.5。类型4以肠杆菌科（Enterobacteriaceae）成员为主，主要富集Serratia、Enterobacter、Citrobacter 和 Klebsiella等机会致病菌属（图 1C）。

此外，我们在4种类型之间比较MetS相关临床指标后发现，类型3和类型4研究对象的腰围、空腹血糖、甘油三酯、收缩压和舒张压水平均较高，而HDL-C水平较低（图1D）。相比之下，类型1和类型2研究对象的代谢相关临床表型相对更优，这可能与其分别富集Bacteroides和Prevotella的群落有关。既往研究表明，Bacteroides在维持葡萄糖稳态和整体代谢平衡中具有重要作用。同时，以Prevotella为优势菌的肠道菌群通常具有更强代谢植物来源碳水化合物的能力，并可在富含复杂碳水化合物和膳食纤维的饮食条件下产生更多短链脂肪酸（SCFAs）。SCFAs与葡萄糖和脂质代谢、胰岛素敏感性以及炎症反应调控密切相关，因此可能在维持代谢健康中发挥重要作用。随后，我们基于线性判别分析效应量（LEfSe）筛选得到的差异菌属构建了属水平共变网络。结果显示，非MetS研究对象富集菌属之间形成了一个较为致密的网络模块，其中Bacteroides、Faecalibacterium和Parabacteroides等菌属之间主要呈正相关关系。MetS患者富集菌属在网络中的分布较为分散，未形成与非MetS研究对象相似的致密模块结构（图1E）。

我们首先采用单因素PERMANOVA评估宿主因素、环境因素以及生活方式对肠道菌群差异的解释程度。结果显示，地理位置是影响肠道菌群组成差异的首要因素。在非地理因素中，NO₂、环境温度和PM_2.5的解释度也相对较高，分别位列第1、第6 和第7位，提示大气污染物和气象条件是影响肠道菌群组成的重要因素（图2A）。在此基础上，我们进一步分析了关键菌属与环境因素之间的关系，重点关注群落类型相关菌属以及LEfSe筛选得到的差异菌属。结果显示，这些菌属与NO₂、PM_2.5和环境温度的关联大致呈现两种相反的模式。例如Megamonas、Megasphaera、Acidaminococcus和Bacteroides等菌属，与NO₂和PM_2.5呈正相关，与环境温度呈负相关。另一类菌属，如Pseudomonas、Lactobacillus 和Ochrobactrum，则与大气污染物呈负相关，与环境温度呈正相关（图2B）。

随后，我们进一步评估了环境因素与MetS的关联。Logistic回归分析结果显示，暴露于较高水平的NO₂和PM_2.5与MetS风险增加相关，而暴露于较高的环境温度则与MetS风险降低相关。具体而言，NO₂、PM_2.5和环境温度每增加一个四分位间距，发生MetS的OR值分别为1.114（95% CI：0.993–1.250）、1.128（95% CI：1.000–1.273）和0.833（95% CI：0.798–0.976）。四分位分组分析也呈现出相似趋势，即暴露于较高水平的NO₂和PM_2.5与MetS风险增加相关，而暴露于较高水平的环境温度则与MetS风险降低相关（图2C和表S3）。

为进一步探讨肠道菌群在其中可能发挥的作用，本研究进行了探索性统计中介分析。把肠道菌属作为中介变量纳入模型后，共有6个菌属，即 Megamonas、Megasphaera、Ruminococcus、Acidaminococcus、Butyricimonas 和 Fusobacterium，在 NO₂、PM_2.5及环境温度与MetS的关联中具有中介作用，且FDR均< 0.1（图2D和表S4）。需要指出的是，由于不同菌属之间存在相关性，基于单一中介模型得到的结果应该作为探索性筛选信号进行解读。此外，基于logistic模型估算得到的中介比例是相对间接贡献，不能简单理解为不同菌属各自独立的贡献，也不代表绝对风险尺度上的中介比例。在所有菌属中，Megamonas的中介比例最大，其在PM_2.5、NO₂和环境温度与MetS关联中的中介比例分别为 15.1%、16.1% 和 4.7%。Megasphaera的相应中介比例分别为 6.3%、9.9%和3.1%。Ruminococcus对PM_2.5与MetS关联的中介比例为 8.4%，对环境温度与MetS关联的中介比例为 4.7%，而在NO₂与MetS关联中未观察到中介作用。Acidaminococcus对PM_2.5、NO₂和环境温度与MetS关联的中介比例分别为5.9%、5.0%和3.3%。

上述结果提示，肠道菌群可能在环境暴露与MetS之间发挥一定的中介作用，但不同暴露因素对应的中介模式不同。在大气污染物与MetS的关联中，Megamonas、Megasphaera和Acidaminococcus是主要的中介菌属。已有研究发现，Megamonas携带参与肌醇降解的相关基因，且实验研究表明Megamonas rupellensis定植可增强肠道脂质吸收并促进肥胖。此外，日本一项研究发现Megasphaera丰度与 2 型糖尿病呈正相关。另一项荟萃分析则提示，肥胖成年人中 Acidaminococcus的相对丰度高于非肥胖成年人，说明这两个菌属均可能与不良代谢状态有关。不过，目前关于其具体机制的直接证据仍较有限，尤其是在污染相关代谢异常中的作用，仍需进一步深入研究。对于环境温度，其中介作用主要由Butyricimonas、Megamonas、Ruminococcus和Acidaminococcus驱动。值得注意的是，Megamonas和Acidaminococcus在大气污染和环境温度分析中均显示出一致的中介效应，提示这些菌属可能通过共同的生物学通路参与环境暴露对MetS的影响。既往研究发现，Butyricimonas是高温高湿暴露小鼠中的差异菌属，并与血浆胰岛素和葡萄糖水平变化相关。同时，Ruminococcus与碳水化合物发酵异常、肠屏障功能受损及慢性低水平炎症有关，这些过程与机体能量平衡密切相关，并可能对温度变化引起的生理扰动较为敏感。总之，这些发现表明，特定肠道菌属可能中介环境暴露对代谢疾病的影响，也进一步支持了肠道菌群作为MetS预防和干预潜在靶点的可能性。

MetS的定义依据中国Ⅱ型糖尿病预防与治疗指南，至少满足以下5个标准中的3个：

1. 腰围：男性 > 90 cm（厘米）、女性 > 85 cm（厘米）；

2. 空腹血糖 ≥ 6.1 mmol/L（110 mg/dl）或之前已被诊断为糖尿病；

3. 收缩压/舒张压 ≥ 130/85 mm Hg或之前已被诊断为高血压；

4. 甘油三酯 ≥ 1.7 mmol/L（150 mg/dl）；

5. 高密度脂蛋白胆固醇< 1.04 mmol/L（40 mg/dl）。

原始Illumina测序数据主要采用QIIME（1.9.1版本）结合Greengenes数据库进行清理。分类变量采用卡方检验进行比较，连续变量则采用t检验或Wilcoxon秩和检验进行组间比较。采用随机森林模型筛选与MetS相关的大气污染物，通过平均下降基尼系数对候选因子进行重要性排序。我们根据变量重要性对大气污染物进行排序，并选取PM_2.5和NO₂作为主要的颗粒物和气体污染物（图S6）。为检验结果的稳健性，我们还构建XGBoost模型，并利用 SHAP值验证污染物排序及其效应方向的稳定性（图S7）。此外，基于既往关于温度变化与代谢健康相关的研究证据，我们将环境温度作为主要的气象暴露因素。

我们采用 Shannon 指数、Chao1指数、Observed species和PD whole tree评估肠道菌群的α多样性。其中，Chao1指数和Observed species主要反映微生物丰富度，Shannon指数同时反映丰富度和均匀度，PD whole tree则反映系统发育多样性。我们基于属水平相对丰度计算Bray-Curtis相异度矩阵，并进行主坐标分析（PCoA）来评估β多样性模式。随后，将前50个主坐标轴作为UMAP的输入，以获得能够保留局部邻域结构并捕捉群落变异主要模式的低维嵌入。随后在UMAP空间中基于欧氏距离进行K-means聚类，通过肘部法则确定群落类型数目（k = 4）。随后将这些群落类型作为节点，利用Slingshot方法推断潜在的群落转变轨迹，并将MetS患病率最低的群落类型设定为根节点，估计一条主谱系，在该谱系上为每个样本赋予一个拟时序值，以概括群落组成变化的主要模式。

为识别各肠道菌群类型中富集的菌属，我们将每个类型中属水平丰度与其余所有样本进行比较。首先，在属水平相对丰度数据中添加微小伪计数后进行中心化对数比变换。随后，采用双侧 Wilcoxon 秩和检验评估组间差异，并以ΔCLR表示效应量。多重比较采用Benjamini-Hochberg方法进行控制，以降低假阳性的可能性。将FDR校正后P值 < 0.05且 |ΔCLR| > 1的菌属定义为该群落类型中的富集菌属。采用线性判别分析结合效应量分析（LEfSe）识别MetS患者与非MetS研究对象之间显著差异丰度的菌属。基于LEfSe筛选出的菌属，我们进一步构建了基于相关性的共变网络。在网络分析前，我们向属水平相对丰度中加入较小的伪计数并进行CLR转换，随后基于CLR转换后的数据计算相关性。保留|ρ| ≥ 0.4且FDR < 0.05的相关性用于构建网络。此外，我们使用R软件vegan包中的Adonis函数进行单因素置换多元方差分析（PERMANOVA），以评估地理因素、环境因素、人口学特征、生活方式因素及MetS相关临床指标对肠道菌群组成变异的解释程度。Adonis函数基于Bray-Curtis相异度矩阵并进行999次置换检验。

我们采用广义线性模型，在调整潜在混杂因素后估计环境暴露因素与肠道菌属之间的关联。进一步采用多因素Logistic回归模型，在相同协变量校正下评估环境因素暴露与MetS之间的关联。关联的显著性基于名义显著性（P < 0.05）和研究范围显著性（FDR < 0.05）进行判定。我们在反事实框架下开展中介分析，针对先前筛选识别出的菌属，检验每种环境因素暴露与MetS的关联是否可通过这些属水平的微生物特征进行统计分解。分析采用R软件mediation包实现。在建模前，对属水平相对丰度进行对数转换，以减少偏态分布并提高模型稳定性。中介分析的P值采用FDR进行控制，FDR阈值为0.10。中介比例（Prop）是在 logit 尺度上计算的，为间接效应估计值与总效应估计值的比值。鉴于OR的非可折叠性，Prop被解释为对关联进行探索性、尺度依赖的分解。

所有统计分析均在 R 软件（版本 4.3.0）中完成。所有统计检验均为双侧检验，除非特别注明，以 P < 0.05 视为差异有统计学意义。

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