编辑丨王多鱼
排版丨水成文
大多数遗传疾病源于特定的序列突变，需要精准修正才能进行治疗干预。尽管碱基编辑器（Base Editor）和先导编辑器（Prime Editor）在修正致病突变方面展现出前景，但其临床应用受到个体突变罕见性和多样性的限制。
靶向基因插入可提供一种通用策略来修正给定基因内的所有致病突变，从而提供一种广泛适用的解决方案。依赖于双链断裂（DSB）诱导修复途径的常规策略，例如非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR），同样存在若干局限性。基于 NHEJ 的方法通常编辑效率在 1%-5%之间，并且容易出现不可预测的插入、缺失或重排。尽管 HDR 可利用供体 DNA 模板实现更精确的基因整合，但它主要局限于分裂细胞，在非分裂或缓慢分裂的细胞（包括许多临床相关细胞类型）中效率低下。
因此，大片段 DNA 的高效和精准整合，仍是充分挖掘基因组编辑的治疗潜力所面临的一个重大挑战。
精确、位点特异性的大片段基因序列插入，对于多种遗传疾病的治疗具有巨大前景。尽管使用 pegRNA 的先导编辑能够介导靶向整合，但对于超过 300 bp 的有效载荷，其插入效率会急剧下降。
先导编辑能够在基因组定点高效生成 3' flap 这一关键中间结构，该团队此前发现，成对使用先到编辑系统可产生一对序列互补的 3' flap，其空间构型直接决定编辑结局：在PAM-out 构型中，互补的 3' flap 促进两个切口之间基因组序列的重复，而在 PAM-in 构型中，则可实现目标序列的精准插入，同时删除两切口之间的原有基因组片段。
在这项最新研究中，研究团队提出了一种理性设计的四重 pegRNA 策略——QuadPE，用于高效且可编程地插入大片段 DNA。通过筛选不同的设计，研究团队发现，一对基因组靶向的 pegRNA 以 PAM-out 或 PAM-in 方向组合，产生两条 3' flap（flapA/B）作为引物；另一对线性或环状形式的供体靶向的 pegRNA 生成互补的 3' flap（flapC/D），从而引导供体 DNA 片段定点整合至目标位点。
利用 QuadPE 技术，研究团队实现了 1.6 kb 至 26 kb 的大片段 DNA 的稳定整合效率，在多个位点的整合效率可高达 40%，且脱靶插入活性极低。
QuadPE 在性能上大幅超越了重组酶介导的基因插入系统（PASSIGE 和 PASTE）和转座酶介导的插入系统（CAST），尤其是在整合较大片段 DNA 的情况下，对于 9.5 kb 的超大 DNA 片段的插入，相比 PASSIGE、PASTE 和 CAST，QuadPE 的效率分别提高了 11 倍、61 倍和 12 倍。
值得注意的是，QuadPE 在分裂细胞和非分裂细胞（例如人类原代 T 细胞、有丝分裂后神经元）中均有效，这确立了 QuadPE 作为一种无需双链断裂或重组酶即可实现大片段基因插入的强大且精准的平台。
https://www.nature.com/articles/s41586-026-10395-w