要获取具有米级长度突起和纳米级特化结构的神经元的结构信息，需采用一种跨多空间尺度的成像技术。多光束 Array Tomography 体电镜是一种结合 Array Tomography（阵列断层成像） 样品制备与多光束扫描电子显微镜（Multi-beam SEM） 的高通量、大体积、纳米级分辨率三维神经结构成像技术。它突破了传统电镜通量低的瓶颈，在保持纳米级分辨率的同时，实现了大体积、高效率、可关联的神经环路三维解析，是构建全脑连接组不可或缺的工具之一。
小鼠脑组织多尺度神经元成像中电镜技术核心目标是实现从宏观脑区到纳米级突触结构的连续成像。
Fig1 小鼠脑组织多尺度光镜与电镜联合成像
该阶段需完成从 “光镜成像后的脑片” 到 “电镜兼容样品” 的转化，核心是通过固定、染色、包埋等操作保留超微结构，同时确保与前期 LM/EM 双标记（EGFP-APEX2）的兼容性：
脱透明与二次固定
将完成 CLSM 成像的 ScaleSF 透明脑片用 PBS 洗涤两次（15 分钟/次），去除残留透明剂。随后在 4% PFA + 0.2% 戊二醛（0.1 M PB, pH 7.4）中 4℃固定 16–20 小时（可将 GA 提高至 0.5%–2% 以增强超微结构保存），再用 PB 洗涤两次。
冷冻保护与切片
脑片在 30% 蔗糖/PB 中 4℃渗透至沉底（4–6 小时），OCT 包埋后于液氮预冷异戊烷中快速冷冻。使用冷冻切片机切取 50 μm 重切片，收集于冰上 PB 中；短期可 4℃保存于含 NaN₃ 的 PBS（若后续需 APEX2 反应则禁用 NaN₃）。
EM 特异性标记（ABC/DAB-Ni²⁺）
切片封闭后，4℃孵育 ABC 复合物 24 小时；冰上进行 DAB-Ni²⁺ 显色（加 H₂O₂ 启动反应，1–5 分钟），NaN₃ 终止后 PBS 洗涤，可于 1% PFA/PB 中 4℃保存 1 个月。
锇染与脱水
1% OsO₄ 室温避光染色 2 小时，PB 和 ddH₂O 充分洗涤后，梯度乙醇脱水（50% → 100%），再经环氧丙烷过渡两次。
树脂包埋与修块
先用环氧树脂:环氧丙烷（1:1）渗透 1 小时，再换纯 Luveak-812 树脂渗透过夜。包埋于硅烷化载玻片，60℃ 聚合 2 天。聚合后分离切片，光学显微镜下定位 ROI（如黑质突触区），修整树脂块用于后续电镜制样。
连续超薄切片制备
将修整后的树脂块垂直固定于 Luveak-812 树脂底座（“rocket”），用 Leica Ultracut UCT 超薄切片机配合 45° 钻石刀切取 30–70 nm 连续切片（厚度误差 < 5 nm）。切片以短条带形式收集于 150 目铜网上，超净台中室温晾干。
MultiSEM成像参数设置
样品置于高真空环境（>10⁻⁴ Pa）；同时采集二次电子（SE，1–3 nm 分辨率，用于突触细节）和背散射电子（BSE，用于定位 DAB-Ni²⁺ 标记区域）；加速电压 80 kV，单束电流 10–20 pA，91 束并行扫描；像素尺寸设为 4 nm（可调至 1.2 nm），采用六边形多视野（mFoV）拼接，7 个 mFoV 覆盖 1 mm² 区域（30 nm 切片下约 6.5 分钟/层）。
大体积连续图像采集
先低倍（100×）定位目标脑区（如黑质），按切片顺序全 ROI 扫描并自动保存（文件名含序号）。每 10 张切片抽检 1 张，检查突触囊泡（40–60 nm）清晰度与 DAB 标记衬度，必要时调整参数。
图像预处理与对齐
使用 ImageJ 降噪（高斯滤波 σ=0.5–1.0）并增强对比度。通过 Imaris 或蔡司软件基于血管或胞体等内源标志点进行刚性对齐，确保对齐误差 < 1 像素（< 4 nm）。
结构分割与 3D 建模
利用 Ilastik 或手动勾画，分割 DAB 标记的神经元胞体、轴突终末、突触间隙（20–30 nm）及活性区/PSD。堆叠后生成 3D 神经网络拓扑图与突触空间分布热力图。
定量分析
统计突触数量、囊泡密度、轴突体积等；构建局部连接矩阵，分析连接强度；在 ≥1 mm³ 体积中量化长程投射密度。
使用 Hitachi H-7650（80 kV）先低倍定位 ROI，再以 50,000–100,000×采集高分辨图像（1.2–16.1 nm/pixel），重点验证突触间隙、囊泡形态及 PSD 特征。将 TEM 图像与 MultiSEM 对应区域比对，确认结构尺寸与位置一致性（偏差 < 5 nm），保障大体积成像可靠性。