低水平HER2基因扩增与IHC检测的瘤内异质性相关，二者均会影响新辅助抗HER2治疗的疗效。
人表皮生长因子受体2阳性（HER2+）乳腺癌约占所有乳腺癌的15-20%[1]。尽管相当比例的患者可通过HER2靶向单克隆抗体（曲妥珠单抗与帕妥珠单抗）的新辅助治疗获得显著或完全的病理缓解，但仍有大量患者反应欠佳，存在高残余肿瘤负荷（RCB）[2]。因此，探索患者治疗反应的影响因素对改善预后具有重要意义。
约40%的HER2+乳腺癌存在瘤内异质性（ITH），表现为肿瘤内部HER2基因扩增或蛋白表达的异质性分布[3]。已有研究表明，荧光原位杂交（FISH）检测的HER2基因扩增ITH可显著降低曲妥珠单抗的疗效，而免疫组织化学（IHC）显示的HER2蛋白表达异质性的临床意义尚待明确[4]。此外，关于HER2的IHCITH是否能够反映HER2基因的扩增状态，以及这二者如何影响肿瘤对HER2靶向新辅助治疗的反应尚待阐明。
最近的一项回顾性研究深入分析了HER2的IHC ITH与FISH检测的HER2基因扩增之间的关系，并基于RCB分级评估了二者对HER2靶向治疗联合化疗（NACT）新辅助治疗反应的影响[5]。结果显示，现将该研究主要内容梳理如下，以飨读者。
研究方法
该研究检索并分析了2014年1月至2023年12月在匹兹堡大学医学中心Magee-Womens医院接受NACT治疗后进行手术的HER2+乳腺癌病例，排除了既往归类为FISH第2组（HER2/CEP17≥2.0且平均HER2拷贝数<4.0），但根据2018版ASCO/CAP指南重新归类为HER2-的患者，以及无法评估RCB的患者。HER2+病例定义为：IHC3+或IHC2+且FISH检测显示HER2基因扩增。该研究将HER2的IHC ITH的定义为：肿瘤内存在至少三种不同染色强度，且弱染色或无染色的肿瘤细胞占比≥10%（图1）。
图1 HER2 的IHC ITH。（A）IHC3+肿瘤的ITH；（B）IHC2+肿瘤的ITH。
采用方差分析（ANOVA）及相应效应量η2分析患者年龄、肿瘤大小、Ki-67比例、sTIL水平与RCB分级（0-3级）的关系。通过Pearson卡方独立性检验（χ²）结合效应量（Cramer's V）和校正标准化残差，分析了RCB分级与诺丁汉分级、淋巴结（N）分期、雌激素受体/孕激素受体（ER/PR）状态、HER2的ITH及HER2扩增水平之间的相关性。p<0.05设定为统计学显著。
研究结果
该研究共纳入了205例接受NACT治疗并可评估RCB的HER2+乳腺癌病例。根据2018 ASCO/CAP指南，将HER2状态分为五组：IHC3+组、Gp1-High、Gp1-Int、Gp1-Low以及Gp3组（表1）。
表1 研究分组情况
临床病理特征总结如表2所示，各组患者平均年龄52-57岁，平均肿瘤大小3.8cm。
表2 各组的临床病理特征分布
根据治疗后的RCB分级进一步分析了治疗前临床病理特征。如表3所示，RCB分级与患者的平均年龄无显著相关，与诺丁汉分级无显著相关性，与肿瘤大小呈正相关（RCB 0级平均2.7 cm增至RCB 3级4.6 cm，p=0.058，临界显著），与ER状态无显著相关性（p=0.260），与低N分期（p<0.001，Cramer's V=0.269）和PR-（p=0.015，Cramer's V=0.269）显著相关。此外，RCB 0级中80%病例为PR-，而RCB 3级中仅33.3%，提示PR-肿瘤对抗HER2治疗更敏感；Ki-67从RCB 0级的58.5%降至RCB 3级的46.7%（p=0.362，统计学不显著）；sTIL百分比从RCB 0级的21.9%降至RCB 3级的9.4%（p=0.132，统计学不显著）。
表3 根据治疗后RCB分层的治疗前临床病理特征
在144例可评估IHC的患者中，43.1%（62/144）的病例存在ITH。如表4所示，ITH在HER2低扩增组中显著更常见，而HER2低扩增组呈现更弱的ITH（p<0.001），两组的组内比较均无显著差异。这些结果提示，HER2表达水平越低，其IHC ITH程度越高。
表4 HER2的ICH ITH分布
表5显示，无ITH的病例集中分布于IHC 3+组和Gp1-High扩增组，而高ITH发生率集中于Gp1-Int、Gp1-Low和Gp3组。卡方检验再次证实，HER2分组与ITH存在极强关联（χ2=47.33，p<0.001，Cramer's V=0.573）。在HER2的空间分布方面，镶嵌型和簇状型为主要类型，占比>95%，散在型为罕见类型，占比<5%。
基于上述发现，该研究中将Gp1-Int、Gp1-Low及Gp3组统一定义为HER2低扩增组（Low Amp），其共同特征为：ITH发生率>80%，平均H-score<160，空间分布呈非均质模式。
表5 HER2的ICH ITH与 HER2分组的相关性
如表6所示，首先，HER2的IHC ITH与RCB分级呈显著正相关（p<0.001，Cramer's V=0.472）。在获得pCR（RCB 0）的患者中仅9.1%存在ITH，而RCB 1、2、3级的患者中，ITH发生率分别为11.4%、53.2%和76.2%。这提示HER2表达异质性越高，患者对NACT的治疗反应越差。
其次，IHC 3+的肿瘤在RCB 0组占比高达93.3%，但随着RCB分级升高比例递减（RCB 1：61.2%；RCB 2：49.5%；RCB 3：23.3%）。相反，低扩增水平的肿瘤（HER2拷贝数4-8或HER2/CEP17<4）在RCB 0中未见，而在RCB1-3级的比例依次递增（18.4%、32.4%、56.7%），且与RCB显著相关（p<0.001，Cramer's V=0.312）。
连续变量分析显示，具有IHC ITH组的RCB评分显著高于无ITH组（2.6±1.1 vs 1.5±1.0，p<0.001），HER2低扩增组的评分也显著高于高表达组（2.5±1.0 vs 1.8±1.0，p<0.001）。这些结果证实，HER2表达ITH和高扩增水平是预测NACT良好疗效的重要指标。
表6 治疗后RCB分层与HER2的IHC ITH和HER2扩增水平的相关性
图2也进一步证实了以上结论，在pCR组（RCB 0）中，HER2 IHC 3+且无ITH的病例占比>90%，但随着RCB分级升高，该比例急剧下降。相反，具有ITH的低水平HER2扩增亚组（Gp1-Int、Gp1-Low和Gp3）在RCB高级别中的比例较高，其中RCB 3组中76.2%的病例同时具备HER2低扩增以及ITH特征。
然而值得注意的是，单独ITH或HER2低扩增状态均不能完全解释NACT治疗疗效不佳，当两者同时存在时，治疗反应则显著恶化。这一发现提示，临床评估需要综合考虑HER2的扩增水平和ITH特征，以更准确地预测疗效。
图2 基于HER2扩增水平与IHC ITH的病例分布特征
在HER2 IHC 3+的肿瘤中，无ITH组的均匀强阳性染色细胞比例显著高于ITH组（87%±14.5% vs 34%±21.3%，p<0.001），且与RCB分级显著相关。然而，在IHC 2+的肿瘤中，这一指标与ITH状态、HER2/CEP17比值及RCB分级均无显著统计学关联，仅与HER2基因拷贝数显著相关（p<0.001）。这些表明，在IHC 3+和IHC2+的肿瘤中，单纯依靠均匀强阳性膜染色细胞比例作为评估指标的临床意义有所不同。
研究结论
这项回顾性研究结果表明，低水平HER2基因扩增与IHC的ITH相关，并且二者均会影响抗HER2新辅助治疗的疗效。HER2表达均一且高表达的肿瘤更容易获得pCR，而HER2存在IHC ITH和低水平扩增的肿瘤则可能带来较高的RCB。值得注意的是，HER2低水平扩增与ITH不仅各自独立影响疗效，当二者同时存在时还会产生协同效应，显著增加NACT失败的风险。这强调，在预测HER2+乳腺癌患者NACT疗效以及制定个体化治疗方案时，需要同时考虑HER2扩增水平和ITH特征。
此外，该研究发现，尽管均匀强阳性膜染色细胞百分比在IHC 3+肿瘤中显示出与ITH和RCB分级的显著相关性，但在IHC 2+肿瘤中仅与FISH检测的HER2拷贝数相关。因此，还需要更多探索以进一步明确是否需要量化ITH程度，以及半定量H-score是否可作为ITH程度的替代指标。
综上，未来需要通过更多大规模的前瞻性研究，结合分子特征分析和标准化ITH评估，进一步完善HER2+肿瘤，特别是低水平基因扩增肿瘤的疗效预测体系。