湖南省农业科学院单杨院士团队：通过蔗糖磷酸解途径消除酿酒酵母中的Crabtree效应 | 《自然-通讯》论文

日益增长的环境友好性与资源可持续性需求，正推动着化学品及食品基质的生物制造研究热潮。然而，要实现规模化生物制造的可行性，碳源利用的优化至关重要—这不仅是实现碳中和目标的核心环节，更是当前微生物生物合成领域面临的首要挑战。达成该目标需要同时满足"产出最大化"与"原料投入最小化"的双重要求。重构微生物中心碳代谢是提高碳源利用效率的关键策略。但微生物代谢网络由大量相互依存的化学反应构成，这些反应不仅形成复杂的动态平衡体系，更具有高度互联的拓扑结构。这种特性导致单一反应的改变可能引发级联效应，使得代谢网络的调控改造异常困难。更值得注意的是，其中许多反应直接关联细胞核心功能与基础代谢活动，如何在维持细胞正常活性的前提下重塑代谢网络成为关键科学问题。因此，当前研究的核心矛盾在于：如何在不损害细胞活性的前提下，实现碳源利用效率的最大化。

酵母的蔗糖代谢主要由以下关键基因调控：胞外蔗糖水解酶基因SUC2、麦芽糖酶基因MAL12/MAL32、异麦芽糖酶基因IMA1-5以及α-葡萄糖苷通透酶基因MPH2/MPH3。为构建蔗糖磷酸化通路，作者采用多基因编辑质粒系统敲除了蔗糖水解相关基因及转运蛋白基因MAL31，同时保留MAL11维持正常蔗糖转运，最终获得ZQS01-ZQS03三组工程菌株。在以蔗糖为唯一碳源的YPD培养基中，ZQS03表现出生长缺陷。为了验证蔗糖磷酸解途径，作者在ZQS03中引入LmSP基因，可将蔗糖磷酸解为果糖和1-磷酸葡萄糖，改造后的ZQS04菌株恢复了蔗糖代谢能力。为提升能量利用效率，作者用外源PvSUF替代MAL11构建ZQS06菌株（同时携带LmSP），但该菌株出现蔗糖利用障碍，且增加蔗糖浓度未能改善生长，表明其缺陷并非底物不足所致。通过过表达相关基因定位限速步骤，发现恢复MAL11表达的ZQS13菌株可重建蔗糖代谢能力，证实PvSUF单独转运效率不足。为此，作者在ZQS05中整合了具有增强转运活性的突变体PvSUF^{I209F C265F G326C}与LmSP，所得ZQS14菌株虽恢复生长但滞后期延长。最终通过共表达突变型PvSUF与MAL11获得ZQS15菌株，其ATP水平显著提高，证明部分蔗糖通过不耗能的突变型PvSUF完成转运。

为探究蔗糖磷酸解对Crabtree效应的影响，作者比较了ZQS15菌株在蔗糖与葡萄糖培养基中的乙醇积累情况。结果显示，ZQS15在蔗糖培养基中乙醇积累显著减少，且生长未受抑制。推测这是由于蔗糖转运速率较葡萄糖缓慢，使碳源得以渐进释放，从而缓解了Crabtree效应。进一步分析发现，蔗糖磷酸解途径中NADH/NAD⁺比值降低，表明氧化还原平衡改善，代谢模式部分转向呼吸依赖状态。肌醇焦磷酸酶（OCA5）是调控EMP与呼吸平衡的关键因子，其缺失可缓解糖酵解对呼吸的抑制。作者在ZQS15基础上敲除OCA5获得ZQS16菌株，该菌株虽维持相同生长速率，但乙醇与甘油积累显著降低，NADH/NAD⁺比值进一步下降，证实呼吸能力增强且Crabtree效应减弱。在蔗糖磷酸解模型中，PGI1基因作为EMP与PPP途径的关键连接点，其存在维持了高糖酵解通量，导致代谢溢流并引发乙醇/甘油积累。为验证这一假设，作者分别构建了ZQS15（OCA5）和ZQS16（OCA5Δ）的PGI1敲除株ZQS17与ZQS18。对ZQS17/ZQS18的代谢分析显示：乙醇零积累、甘油极微量，NADH/NAD⁺比值进一步降低，证明PGI1Δ菌株在蔗糖磷酸解途径中呈现Crabtree阴性表型。尽管PGI1敲除株的μmax与ZQS16相当，但其滞后期明显延长（ZQS17达34.1 h，ZQS18为23.5 h)，表明PGI1缺失通过降低EMP通量延长了细胞生长周期。

针对Crabtree阴性菌株在蔗糖代谢中滞后期延长的现象，作者通过转录组分析鉴定了调控酵母细胞生长的内源基因。ZQS16/ZQS15菌株在蔗糖中的μmax高于葡萄糖培养条件，而PGI1Δ菌株ZQS18/ZQS17的滞后期较ZQS16/ZQS15显著延长。基于此，作者将比较数据集分为两大组：比较组I-III鉴定出25个差异表达基因（DEGs），比较组IV-VI则发现462个DEGs。结合蔗糖磷酸解菌株生长速率提升、PGI1Δ菌株滞后期延长的表型，作者推测特定基因表达模式可能与这些生长差异相关。通过筛选在比较组I/IV中上调且在III/VI中下调的基因，作者获得16个可能促进细胞生长的候选基因；反之鉴定出10个可能抑制生长的基因。在ZQS18中过表达16个候选基因并敲除10个抑制基因后发现：THI7过表达或CSM4/PHO89/SDD1/RGI2敲除能显著缩短滞后期。为探究多基因协同效应，作者构建了THI7/CSM4/RGI2不同组合的ZQS45-ZQS47菌株。结果显示多基因组合菌株的滞后期反较单基因改造的ZQS39（RGI2Δ）更长，因此选择滞后期缩短30.8%的ZQS39作为后续研究基础。代谢分析表明：ZQS39的NADH/NAD⁺比值降低且ATP水平升高，但NADPH/NADP⁺比值不变，说明RGI2缺失通过优化糖酵解与TCA循环的代谢平衡，在不影响PPP的前提下改善了能量供应效率。

ZQS39菌株由于缺乏乙醇和甘油积累，导致胞质NADH再氧化受阻。为增强胞质NADH的ATP合成效率，作者过表达NDE1/NDE2以补偿NADH氧化缺陷，但该策略引发呼吸链过度消耗NADH导致细胞死亡。为此，作者引入转氢酶AcTH，构建NADPH→NADH转化通道。携带NDE1/NDE2/AcTH合成能量系统的ZQS48菌株在蔗糖培养基中恢复正常生长，ATP产量显著提升。该合成能量系统使得细胞在TCA循环供能不足时，仍能通过胞质NADH维持ATP合成。为验证这一功能，作者通过替换弱启动子下调线粒体异柠檬酸脱氢酶IDH2的表达。未装备能量系统的ZQS39菌株随启动子强度降低生长逐渐受限，ZQS53甚至完全停滞；而ZQS48的生长抑制显著缓解，证明合成系统可补偿TCA循环功能缺陷。但ZQS48出现部分乙醇和甘油积累，表明部分NADH仍通过溢流代谢途径氧化。作者推测AcTH导致NADH过度积累，迫使细胞启动溢流代谢维持平衡。为此引入磷酸酮醇酶（LmPK）和磷酸转乙酰酶（CkPTA），构建PPP→乙酰-CoA→TCA循环的新通路，促使代谢流向有氧呼吸。改造后的ZQS59菌株有效降低乙醇积累。为进一步阻断NADH消耗途径，作者依次敲除乙醇脱氢酶基因（ADH1/ADH3）和甘油-3-磷酸磷酸酶基因（GPP1/GPP2），获得ZQS60-ZQS65系列菌株。最终获得的ZQS65菌株将乙醇和甘油控制在极低水平，且NADH/NAD⁺比值稳定。与ZQS39相比，ZQS65的NADPH/NADP⁺比值降低而ATP水平升高，表明合成能量系统高效实现了NADPH→NADH转化，推动NADH进入呼吸链进行氧化磷酸化。

作者进一步通过四种典型产物（乳酸、3-羟基丙酸、对香豆酸和法尼烯）验证了工程菌株ZQS39和ZQS65的合成性能。这些产物分别代表丙酮酸、乙酰-CoA、莽草酸途径和甲羟戊酸途径（MVA）的代谢节点，可系统评估菌株的碳流分配效率。对于乳酸的合成：具备合成能量系统的Crabtree阴性菌株ZQS68滴度达3.29 g/L（产量0.22 g/g蔗糖），较对照ZQS66提升11倍，但略低于未装备能量系统的ZQS67（4.99 g/L）。这表明能量系统会竞争消耗胞质NADH，但相比传统Pdc-阴性菌株（3.20 g/L），ZQS68仍具明显优势。3-羟基丙酸的合成：工程菌ZQS71滴度达1.96 g/L（产量0.15 g/g蔗糖），较ZQS69提升8.2倍（图6e）。与葡萄糖代谢菌株（0.31 g/L）相比，该结果凸显了改造菌株在乙酰-CoA供应效率上的突破。对香豆酸的合成：ZQS74的对香豆酸滴度达215.47 mg/L（产量14.13 mg/g蔗糖），较对照提升了2倍，且显著优于葡萄糖代谢体系（12.90 mg/L）。尽管其提升幅度低于3-HP，可能与较长的合成路径导致代谢流稀释有关。在法尼烯合成中：ZQS77滴度达105.27 mg/L，较对照ZQS75提升22%，产量提高77%。