动物行为与光电专题(53)丨动物行为实验中的钙信号记录

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小鼠MS脑区注射AAV-DIO-GCaMp6M后,在MS植入光纤,用牙科水泥固定。单笼饲养3周使荧光蛋白充分表达并让小鼠恢复状态。光纤记录荧光信号时,从488nm激光器射出一束激发光,经过二项色镜的反射,由*10物镜汇聚,通过一条光纤跳线与小鼠头部植入的光纤射入对应脑区。激发的GCaMP荧光通过滤波后,被光电倍增器采集,再通过放大器将光电倍增管电流信号转化为电压信号。再由低频过滤器过滤,模拟的电压信号在500Hz转化为数字信号再记录。记录到的钙信号在后期通过人工打标与对应行为匹配,并经过Matelab程序分析输出热图和统计图。

摄食实验

小鼠提前一天禁食12个小时。实验时,小鼠在黑暗环境中适应一个小时。通过头部光纤连接光纤记录系统,放入20*20*22cm的透明盒子中,盒子内放入一小块鼠粮。盒子上方安装红外摄像头进行录像。在黑暗环境下记录小鼠接触并进食的时间以及钙信号数据。

糖水实验

小鼠断水12后放入20*20*22cm的透明盒子中,盒子上安装一个给水瓶供小鼠自由舔食。瓶口的金属导管上通过导线连接到仪器检测小鼠每次舔食糖水的次数和时间,黑暗环境下记录小鼠每次获取糖水的时间点以及钙信号数据。口腔内给予糖水以及奎宁,通过小鼠脸颊在小鼠口腔内植入导管,将导管另一端用牙科水泥固定在小鼠头部。实验时,通过小鼠头部的导管连接微量注射泵,在小鼠口腔内给予糖水和奎宁。糖水实验中,小鼠提前断水12个小时。实验时,通过微量注射泵每20-30s给小鼠口腔内注入糖水(5% w/v),速度为20ul/s,持续时间为0.5s。奎宁厌恶实验中,小鼠不需要提前断水,奎宁的浓度为5mM。给药方式与给糖水相似。记录下每次给糖水,奎宁的时间点,以及整个实验过程的钙信号。

足底电击实验

小鼠放入透明塑料盒子中,底部为金属网格板。实验时,小鼠每20-40s内被给予0.7mA,0.5s的电击。持续4次。记录小鼠每次接受电击的时间,以及整个实验过程的钙信号。

足底电击快速激活MS脑区胆碱能神经元

足底电击实验是常用的应激手段,被广泛用于小鼠的恐惧记忆以及创伤后应激综合征(PTSD)的研究。因此首先检测MS胆碱能神经元在小鼠受到电刺激时的神经元活动的变化。小鼠在实验笼内适应2分钟后,每隔20-40秒给予小鼠一次足底电击,电流强度为0.7mA,持续0.5s。发现小鼠在受到电击时,钙信号的强度明显増加,又快速恢复到正常水平。在所有的病毒充分表达,光纤埋植位置正确的小鼠上都看到了上升的钙信号反应。这表明足底电击的应激刺激显著的增强了MS这群胆碱能神经元的活动。同时,反复电击刺激增强了这群胆碱能神经元对刺激的反应强度。

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足底电击快速激活MS脑区胆碱能神经元

A足底电击行为实验示意图;

B小鼠在整个行为检测周期内足底电击引起MS胆碱能神经元钙信号改变的热图,0s表示电击刺激的开始,纵坐标表示刺激事件的次数,横坐标表示每次刺激前后记录的钙信号的时间,比色尺表示热图中△F/F的变化范围;

C一只小鼠足底电击引起钙信号改变的线性图,0s表示电击刺激的开始,红色实线表示所有事件中钙信号改变的平均值,灰色阴影表示所有事件信号改变的标准误;

D实验中电击引起的所有小鼠钙信号改变的线性,每一种颜色的线表示一只小鼠在整个刺激过程的钙信号变化的平均值;

E实验小鼠足底电击前后钙信号改变的平均值的统计分析;

F所有实验小鼠每次电刺激引起的钙信号变化的峰值的平均值的变化。

奎宁引起的苦味感受激活MS胆碱能神经元

运用足底电击和悬尾刺激的刺激方式,可看到应激反应过程中小鼠MS胆碱能神经元的兴奋性显著增加。然而,这两个刺激属于强烈的躯体感觉刺激,小鼠在遭受刺激时会出现明显的挣扎逃跑的运动行为。这可能影响到结论的可靠性。因此引入应外一种应激刺激,即通过口腔给予奎宁溶液产生苦的味觉体验。首先,经过手术作者在小鼠脸颊上开一个口,通过这个口往口腔内植入一根导管用于口腔内给药。导管的另一侧通过牙科水泥固定在小鼠头部。这样就可以通过外接给药泵往小鼠口腔内给奎宁溶液。实验时,通过注射泵,随机的往小鼠口腔内注射奎宁溶液(5MM),速度为20 μL/s,每次持续0.5s。口腔内给予奎宁后记录到的钙信号的值明显增加,并且在结束给药之后的数十秒内钙信号的水平仍然维持在较高水平。在所有的实验小鼠上都看到了类似的结果。这表明苦味的刺激会持续激活MS胆碱能神经元的活性。

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奎宁引起的苦味感受激活MS胆碱能神经元

A小鼠口腔内给予奎宁溶液示意图。

B小鼠在整个行为检测周期内奎宁刺激引起MS胆碱能神经元钙信号改变的热图。

C小鼠奎宁刺激引起的钙信号反应的线性图。

D所有实验小鼠的钙信号改变的线性图。

E实验小鼠奎宁刺激前后钙信号改变的平均值的统计分析。