Cell | 突破！研究人员首次构建功能性人类羊膜囊体外模型，开启胚胎外发育研究新纪元

生物探索

2025-05-20 16:35发布于江苏科学领域创作者

引言

生命最初的十月怀胎，是一个从单细胞到复杂生命的奇迹旅程。然而，在这个生命早期的关键时刻，特别是受精后的第2至4周，胚胎如何在母体子宫中构建起赖以生存的微环境？包裹着胚胎、充满羊水的羊膜（amnion），提供营养支持的卵黄囊（yolk sac），这些至关重要的胚胎外组织（extra-embryonic tissues）是如何精确形成的？它们又在早期胚胎发育中扮演着怎样的角色？

长期以来，这个阶段的人类胚胎发育过程就像一个难以窥探的“黑箱”。严格的伦理限制和复杂的技术屏障，使得研究人员难以直接研究人类胚胎在植入后（post-implantation）到原肠胚形成（gastrulation）这一至关重要时期的发育机制。传统的体外细胞培养或模型，虽然能模拟部分过程，却难以精确重现这些复杂的胚胎外结构及其功能，例如形成一个完整、充满液体、由内外两层细胞构成的功能性羊膜囊。

5月15日发表在《Cell》杂志上的一项重磅研究“Post-gastrulation amnioids as a stem cell-derived model of human extra-embryonic development”，带来了令人振奋的突破！研究人员成功开发出一种全新的、基于人类干细胞的体外三维模型——原肠胚形成后类羊膜囊（Post-gastrulation Amnioids, PGAs）。这个模型不仅在形态、大小上高度模拟了人类胚胎在约4周时的胚胎外结构，包括了类羊膜囊和类卵黄囊，更能忠实地重现它们在细胞组成、分子特征甚至功能分泌方面的关键特性。

这个高度可重现、可扩展的PGAs模型，就像为我们打开了一扇研究人类早期生命发育，特别是羊膜形成（amniogenesis）和胚胎外组织功能的全新窗口。它首次让我们能够在实验室中，以前所未有的精度，去探索那些隐藏在生命早期的奥秘，理解胚胎与邻居们如何相互对话，以及这些“幕后功臣”如何为后续更复杂的发育奠定基础。

如何在实验室里“创造”早期生命“温室”？

构建PGAs的起始材料是处于“启动态”（primed state）的人类胚胎干细胞。研究人员首先将hESCs在二维培养皿中处理24小时，使用低浓度的骨形态发生蛋白4（BMP4）来诱导羊膜外胚层。随后，再用WNT信号激动剂（CHIR）处理24小时，以诱导中胚层谱系。初步处理后的细胞被解离成单细胞，转移到低吸附性的U型板中进行聚集（aggregation），并在基础培养基（E6 media）中培养。

令人惊喜的是，这些细胞聚集体展现出惊人的自组织能力（self-organization）。仅仅在最初的24小时内，聚集体就形成了球状体，并自发地分化成两个不同的细胞群体：一个内部群体表达ISL1、TFAP2C、TFAP2A和GATA3等标记物，类似于羊膜外胚层；一个外部群体表达GATA6和HAND1等标记物，类似于羊膜的外层——胚胎外中胚层。这与人类胚胎在受精后约17-18天（Carnegie Stage 7）时，由内外两层构成的羊膜结构非常相似。

接下来的几天里，这些类羊膜外胚层区域开始形成一个充满液体的腔体（amniotic cavity），并逐渐扩大。通过延时显微镜观察发现，从第1天到第18天，PGAs的形态持续发展。到了第18天，形成了直径约2到3毫米的、充满液体的类羊膜囊结构。这个双层细胞结构还产生了一层基底膜（basement membrane），随着PGAs的扩大而增厚，提供了结构支持。研究人员发现，这些PGAs模型可以在体外生长超过3个月，直径甚至能达到1.5厘米。

更令人印象深刻的是模型的高重现性。研究人员发现，约92%的聚集体都能在10天内形成充满液体的类羊膜囊结构。使用其他人类多能干细胞系（human pluripotent cell lines），如RUES2 hESCs，也观察到相似的高重现性。这意味着这个模型不仅能成功构建，而且非常稳定可靠。

整个构建PGAs的过程，除了最初48小时的二维预处理外，完全是在不含分化因子的基础培养基中进行的，这表明早期信号足以驱动后期的谱系规范和自组织，展示了分化中的多能干细胞卓越的自组织能力。

不仅仅是形状像：模型在细胞和分子层面有多“像”？

为了全面了解PGAs的细胞组成和分子特征，研究人员进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）、蛋白质组学（proteomics）和代谢组学（metabolomics）分析。

通过单细胞RNA测序，研究人员在PGAs中鉴定出9种不同的细胞类型群体，对应着不同的发育阶段。他们看到了类似表皮细胞（epiblast-like cells），表达NANOG、SOX2和POU5F1等核心多能性标记物。还有两群类似羊膜外胚层的细胞，表达ISL1、TFAP2C、TFAP2A和GATA3等标记物。随着时间推移，这些早期羊膜外胚层标记物表达逐渐下降，而GABRP和VTCN1等晚期标记物表达上升，提示羊膜在模型中经历了类似发育的进程。

此外，模型中还包含了四群表达胚胎外中胚层相关基因的细胞群体，它们构成了从类似表皮细胞到晚期中胚层的连续发育进程。早期胚胎外中胚层细胞表达MESP1、MIXL1、TBXT、GATA6等标记物；中期表达APLNR、GATA4、BMP4和LEF1；晚期则表达BST2、POSTN和COL6A3。这些标记物的表达模式与胚胎外中胚层规范过程中的瞬时表达报道相符。

更重要的是，单细胞数据还揭示了模型中存在两群类似卵黄囊的细胞群体——卵黄囊内胚层样细胞和卵黄囊内皮样细胞。卵黄囊内胚层样细胞表达SOX17、HNF4A和APOA1等标记物；卵黄囊内皮样细胞则表达CD34和PLVAP等典型内皮标记物。

为了验证这些细胞类型的鉴定，研究人员将PGAs的单细胞数据与已发表的人类胚胎（受精后约17天）和恒河猴胚胎的体内数据进行比较。结果显示，PGAs中的细胞类型与体内胚胎的细胞类型在转录组水平上惊人地相似，包括类似表皮、羊膜外胚层、内胚层（卵黄囊）、新生/晚期胚胎外中胚层（卵黄囊中胚层）的细胞群都能很好地匹配。

除了细胞组成，PGAs的功能性特征也与人类羊膜相似。羊膜在怀孕期间会产生大量蛋白质和代谢物，支持胎儿的生长和健康。研究人员分析了从PGAs内部（腔内液体）和外部（腔外液体）提取的液体成分。蛋白质组学分析显示，腔内液体和腔外液体的蛋白质组成存在明显差异。共鉴定出2915种蛋白质，其中2370种是腔内液体独有的，524种是共享的，21种是腔外液体独有的。功能富集分析显示，腔内液体富含与分泌和代谢过程相关的通路，而腔外液体则富含与细胞外基质（ECM）组织相关的通路。值得注意的是，腔内液体中富含许多已知与胎儿健康和生长相关的人类羊膜液因子，如热休克蛋白、HGF、G6PD、TGFB2和APOE等。这表明PGAs能分泌与天然羊膜液相似的蛋白质。

与已发表的人类和恒河猴羊膜液蛋白质组数据比较发现，PGAs的腔内液体蛋白质组成与它们有很高的一致性。例如，与已发表的人类羊膜液蛋白质组有768个共享蛋白质。虽然人类羊膜液的组成会随孕龄变化，且受到胎儿和母体相互作用的影响，但PGAs的高度共享蛋白数量表明它是研究不受胚胎和母体影响的羊膜液成分的有用模型。

代谢组学分析也支持了PGAs的功能相似性。腔内液体富含的代谢物，如Hex-2-ulose（肌醇、果糖或葡萄糖）、犬尿酸（kynurenic acid）、肌酸（creatine）、己醇（hexitol）和腺苷单磷酸（adenosine monophosphate）衍生物等，都被报道存在于人类羊膜液中。相反，腔内液体中的叶酸（folic acid）含量低于腔外液体和对照培养基，暗示PGAs对叶酸进行了代谢转化。与之对应的是，腔内液体中富含与叶酸生物合成和下游代谢过程相关的蛋白质，如DHFR、MTHFR、MTHFD1和MTR等。

综上，PGAs不仅在形态和细胞组成上与人类胚胎的羊膜和胚胎外组织相似，还能产生功能上类似人类羊膜液的蛋白质和代谢物。

谁是构建“温室”的关键“建筑师”？

为了深入了解羊膜形成的分子机制，研究人员分析了PGAs在胚胎外中胚层和羊膜外胚层谱系分化过程中，基因表达和转录因子活性（transcription factor activity）的变化。

通过轨迹推断分析（trajectory inference），研究人员确认了模型中从类似表皮细胞向胚胎外中胚层和羊膜外胚层谱系分化的轨迹。进一步的早期差异表达分析（earlyDE analysis）揭示了在谱系分岔点上发生显著变化的驱动基因。基于此，研究人员识别出潜在的胚胎外中胚层驱动基因簇（如RSPO3、BMP5、GATA6、HAND1等）和羊膜外胚层驱动基因簇（如GATA3、GATA2、TFAP2C、ISL1等）。

转录因子活性分析（SCENIC）也预测了这两个谱系的关键转录因子。对于羊膜外胚层，预测的关键转录因子包括GATA3、GATA2和TFAP2C等。

为了验证这些预测，研究人员进行了基因扰动实验。他们使用小干扰RNA（siRNA）敲低（knockdown）了候选基因，观察PGAs形态的变化。结果发现，敲低某些基因会损害PGAs的形成和生长，其中GATA3的敲低影响尤为显著，这强烈提示GATA3在羊膜形成中的重要作用。MSX2、POU5F1等其他基因的敲低也影响了模型的生长。相反，敲低其他基因（如SOX2和NANOG，已知为核心多能性因子）则加速了羊膜形成或导致PGAs更大。

为了测试GATA3是否足以驱动羊膜形成，研究人员使用激活型CRISPR-Cas9（CRISPRa）系统在hESCs中特异性激活了GATA3的表达。令人惊叹的是，即使没有进行通常用于构建PGAs的BMP4和CHIR预处理，仅仅激活GATA3就足以诱导形成充满液体的类羊膜囊结构，并且重现性很高。免疫荧光染色显示，这些由GATA3激活形成的结构同样包含了TFAP2C阳性的内层和GATA6阳性的外层。

这些结果确凿地表明，GATA3在PGAs模型中的羊膜形成过程中既是必需的（necessary）也是充分的（sufficient），并验证了该模型用于遗传学研究的潜力。

不只羊膜：模型还能模拟早期生命哪些“邻居”？

除了羊膜，卵黄囊作为另一个关键的胚胎外组织，在早期胚胎发育中也扮演着多重角色，包括提供营养、气体交换和造血的起始。卵黄囊由内胚层、中胚层和内皮细胞等多种细胞类型构成。

如前所述，PGAs的单细胞数据与人类胚胎和卵黄囊图谱数据集整合分析表明，PGAs模型中确实存在多种卵黄囊样细胞类型。研究人员看到了类似卵黄囊内胚层的细胞群，表达APOA1、APOA2、HNF1B、HNF4A、TTR和FOXA2等标记物。还有类似卵黄囊内皮细胞的细胞群，表达CD34、PLVAP、ESAM、KIT和CDH5等标记物。免疫荧光染色也证实了SOX17阳性和CD34阳性细胞的存在，它们形成了类似卵黄囊的结构。并且，研究人员观察到SOX17表达早于CD34，指示了向更成熟卵黄囊样表型的发育进程。

卵黄囊也包含了来源于胚胎外中胚层的中胚层谱系，它们主要构成了卵黄囊的衬里。在PGAs中，研究人员发现晚期胚胎外中胚层细胞表达卵黄囊中胚层特有的标记物（如PDPN和UPK3B）和卵黄囊成纤维细胞的标记物（如PDGFRA和VCAN），同时也表达POSTN和GATA6等中胚层通用标记物。免疫荧光染色显示，卵黄囊区域内存在PDGFRA阳性细胞，其POSTN表达水平低于周围的中胚层细胞。覆盖卵黄囊和类羊膜囊结构的胚胎外中胚层层表达GATA6和KRT8等通用标记物，并延伸形成一个类似连接蒂（connecting stalk）的结构。

总体而言，这些数据显示，PGAs能够重现人类胚胎受精后约20天时胚胎外组织的发育特征，包括一个类羊膜囊腔、一个类卵黄囊结构以及形成潜在连接蒂的胚胎外中胚层。

有意思的是，在体内，人类卵黄囊在受精后约10周开始萎缩。而在PGAs模型中，类卵黄囊结构在第7天后停止生长并缩小，而双层类羊膜囊继续快速扩大。细胞周期分析显示，晚期胚胎外中胚层（包括卵黄囊中胚层）表达更高的细胞周期抑制基因CDKN1C（p57），而增殖基因（如MKI67、ASPM、TOP2A、CDK1、CCNB1、PLK1）表达较低。这表明与增殖相关的基因表达在卵黄囊成熟期间下调，这可能与羊膜的持续扩张共同导致后期卵黄囊结构的退化。

“邻居”间的“对话”：谁在引导谁？

胚胎外组织被认为在早期人类发育过程中充当信号中心，协调模式形成和形态发生。研究人员观察到，PGAs中的早期胚胎外中胚层细胞和羊膜外胚层细胞在第1天就表达高水平的BMP4和WNT5A等信号分子。这引发了他们的猜想：这些胚胎外谱系产生的信号是否会诱导未处理的胚胎细胞分化和自组织？

为了验证这一假设，研究人员进行了胚胎外细胞和胚胎细胞的共培养实验。他们将经过BMP4和CHIR预处理、已诱导为胚胎外祖细胞（Extra-embryonic Progenitor, EEP）的hESCs，与未处理的（表达mCherry以示区分）多能干细胞（Pluripotent, Pluri）按不同比例混合。在低吸附U型板中培养后，这些混合细胞聚集体在8小时内形成结构。

有趣的是，当EEP和Pluri细胞比例为50:50和75:25时，形成了定义明确的三维结构。在50:50比例下，两种细胞群体整合形成一个类似于PGAs的单一场结构。mCherry阴性（EEP）细胞形成了GATA6阳性的胚胎外中胚层谱系，而mCherry阳性（Pluri）细胞开始表达GATA6并形成类似羊膜囊的腔体，随后扩大形成双层结构。在EEP:Pluri比例提高到75:25时，mCherry阳性（Pluri）细胞也发育出了TFAP2C阳性的羊膜外胚层。这表明胚胎外细胞产生的信号能够诱导未处理的胚胎细胞分化。

为了进一步探究旁分泌信号（paracrine signaling）的作用，研究人员在EEP诱导过程中或EEP与Pluri共培养的最初24小时内，阻断了BMP或WNT信号通路。结果显示，在这些阶段阻断信号会导致3D类羊膜囊结构形成失败。mCherry阳性的多能细胞无法表达TFAP2C，而GATA6的表达也显著减少。

这些结果强有力地表明，胚胎外谱系，尤其是胚胎外中胚层细胞产生的旁分泌信号（很可能是BMP和Wnt信号），对于驱动多能细胞分化形成羊膜至关重要。这暗示着羊膜形成可能存在一个自身调节反馈循环（autoregulatory feedback loop），即胚胎外信号促进了羊膜的规范和形成。

未来可期：PGAs模型能为我们带来什么？

PGAs模型的建立是早期人类胚胎外发育研究的一个重要里程碑。它提供了一个可重现的三维模型，忠实地模拟了人类羊膜和相关胚胎外组织在受精后约2-4周的发育过程。

这个模型具有多项优势：高重现性使得实验结果可靠，可扩展性（scalability）使其适合进行高通量筛选（high-throughput screening）。其精确的细胞、结构和功能完整性，特别是充满液体的类羊膜囊结构，使其成为研究羊膜结构完整性、生物力学特性和羊水功能（如液体交换和屏障作用）的理想工具。

更关键的是，PGAs模型不包含胚胎谱系，这使得研究人员能够隔离地研究胚胎外组织（如羊膜和卵黄囊）自身的功能和发育，以及它们与胚胎细胞之间的相互作用，从而深入探究原肠胚形成后胚胎-羊膜互作的复杂网络。

未来，PGAs模型在多个领域具有广阔的应用前景：

深入研究羊膜形成和胚胎外发育机制：利用PGAs进行遗传扰动和信号通路操纵，可以精确地识别和验证早期发育的关键调控因子和信号通路。

探索胚胎-羊膜互作：通过PGAs与胚胎干细胞的共培养系统，可以研究胚胎外信号如何影响胚胎谱系的分化和组织形成，以及胚胎如何反过来影响胚胎外组织。

药物渗透和致畸性筛选：羊膜作为胚胎的物理屏障，在药物传输和阻隔有害物质方面发挥作用。PGAs模型中的类羊膜囊结构可以用于体外评估药物通过羊膜的渗透性，或测试潜在致畸物的胚胎毒性。

临床应用研究：人类羊膜膜在临床上常用于烧伤、眼科手术和组织修复等领域。PGAs模型可以作为研究羊膜膜功能和开发新型治疗方法的平台。

“温室”的边界：模型的局限性

尽管PGAs模型带来了显著的进步，但它也存在一些局限性。在体内的真实发育环境中，羊膜囊与胎盘的绒毛膜（chorion）以及胚胎本体紧密接触。PGAs模型专门模拟了来源于内细胞团（inner cell mass）的胚胎外谱系，但不包含滋养层（trophectoderm）（它会形成绒毛膜）以及胚胎本体。

由于体内哺乳动物发育过程中存在广泛的旁分泌信号和交叉调控，我们不能排除未包含在PGAs模型中的细胞群体（如滋养层和胚胎本体）可能影响羊膜囊的诱导、成熟和功能。例如，PGAs模型中类羊膜液的蛋白质和代谢物组成可能不完全，可能缺少由其他胚胎外组织或胚胎自身产生的潜在分泌蛋白和代谢物。

认识到这些局限性有助于我们更准确地理解模型能够回答的问题，并为未来的模型改进指明方向。

总的来说，这项研究成功地利用启动态人类胚胎干细胞，在体外构建了一个高度可重现、具有形态和功能完整性的原肠胚形成后人类类羊膜囊模型。PGAs忠实地模拟了人类胚胎在受精后约2-4周的关键胚胎外发育阶段，包含了类似羊膜囊、卵黄囊和胚胎外中胚层的结构。研究利用这一模型，不仅揭示了GATA3是羊膜形成的必要且充分的调控因子，还发现了胚胎外信号，特别是BMP和Wnt信号，在促进羊膜形成中的关键作用，并提出了一个潜在的自身调节反馈循环机制。

PGAs模型的高重现性和可扩展性使其成为研究早期胚胎外发育基本过程、探索胚胎-羊膜互作以及未来用于大规模药物筛选和临床应用研究的强大工具。虽然模型仍有局限性，但它无疑为我们深入了解人类生命最初的奥秘打开了新的大门，也为基于干细胞的体外类器官研究提供了新的思路。

参考文献

Gharibi B, Inge OCK, Rodriguez-Hernandez I, Driscoll PC, Dubois C, Jiang M, Howell M, Skehel JM, Macrae JI, Santos SDM. Post-gastrulation amnioids as a stem cell-derived model of human extra-embryonic development. Cell. 2025 May 9:S0092-8674(25)00458-1. doi: 10.1016/j.cell.2025.04.025. Epub ahead of print. PMID: 40378847.

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