VR I ASFV pS183L 蛋白通过阻断 MDA5 寡聚化负向调节 RLR 介导的抗病毒信号传导
近日，中国兽药监察所邹兴启副研究员联合南京农业大学郑龙三教授与钱莺娟教授成果以“ASFV pS183L protein negatively regulates RLR-mediated antiviral signalling by blocking MDA5 oligomerisation（ASFV pS183L 蛋白通过阻断 MDA5 寡聚化负向调节 RLR 介导的抗病毒信号传导）”为题在 Veterinary Research（Q1 IF:3.7） 发表。在病毒与宿主的这场无硝烟战争中，每一次新的发现都可能成为改写战局的关键。近期，一项关于非洲猪瘟病毒（ASFV）的研究成果引起了科学界的广泛关注。研究表明，ASFV 的 pS183L 蛋白在抑制宿主抗病毒信号通路中扮演着极为重要的角色，尤其是在阻断 RLR 介导的抗病毒信号传导方面，其机制之精巧，让人惊叹。非洲猪瘟，这个养猪业的 “头号杀手”，自出现以来就给全球养猪产业带来了巨大的冲击。由于目前缺乏有效的商业疫苗，其防控难度极大。深入了解 ASFV 的致病机制和免疫逃逸策略，成为了攻克这一难题的关键。而此次关于 pS183L 蛋白的研究，无疑为我们揭开了 ASFV 神秘面纱的一角。我们先来了解一下 RLR 介导的抗病毒信号通路。这是宿主免疫系统抵御病毒入侵的一道重要防线。当病毒入侵细胞时，细胞内的模式识别受体 RLR 能够识别病毒的核酸，进而激活一系列的信号传导，最终诱导干扰素等抗病毒因子的产生，启动宿主的抗病毒免疫反应。然而，ASFV 的 pS183L 蛋白却如同一个狡猾的 “破坏者”，精准地找到了这一防线的薄弱点。研究人员发现，pS183L 蛋白能够特异性地阻断 MDA5 的寡聚化过程。MDA5 作为 RLR 家族的重要成员，其寡聚化是激活下游信号传导的关键步骤。就好比 MDA5 是一把钥匙，只有当它 “组装” 成正确的形状（寡聚化），才能打开激活抗病毒信号通路的 “大门”。而 pS183L 蛋白的出现，就像是在钥匙孔里塞了一把错误的 “异物”，让 MDA5 无法正常寡聚化，从而阻断了整个抗病毒信号的传递。为了证实这一发现，科研团队进行了一系列严谨的实验。在细胞实验中，他们观察到，当细胞感染了携带 pS183L 蛋白的 ASFV 病毒后，MDA5 的寡聚化水平明显降低，下游的抗病毒信号分子的激活也受到了显著抑制。进一步的分子生物学实验表明，pS183L 蛋白与 MDA5 之间存在直接的相互作用，这种相互作用改变了 MDA5 的空间构象，使其无法正常聚集形成寡聚体。这一研究成果的意义不仅仅在于揭示了 ASFV 的一种新的免疫逃逸机制，更重要的是，它为开发针对非洲猪瘟的新型防控策略提供了潜在的靶点。如果我们能够找到一种方法，干扰 pS183L 蛋白与 MDA5 的相互作用，或者阻断 pS183L 蛋白的功能，那么就有可能重新激活宿主的抗病毒免疫反应，为非洲猪瘟的防控带来新的希望。目前，相关的研究仍在紧锣密鼓地进行中。科研人员正在进一步探索 pS183L 蛋白的结构与功能关系，希望能够设计出更加精准有效的干预手段。同时，这一发现也为我们理解其他病毒与宿主之间的相互作用提供了新的思路和参考。在这场与病毒的赛跑中，每一次新的突破都来之不易。让我们共同期待，随着研究的不断深入，能够早日找到战胜ASFV有效方法，为全球养猪业的健康发展保驾护航。非洲猪瘟（ASF）由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起，是一种影响家猪和野猪的急性出血性疾病。自 1921 年在肯尼亚被确认以来，非洲猪瘟已蔓延至非洲、欧洲和亚洲。高致死性的基因 II 型 ASFV 毒株于 2018 年 8 月在中国沈阳首次被报道。从那以后，它几乎传播到了中国的所有省份，造成了巨大的经济损失。随后的监测研究表明，由于高毒力 ASFV 毒株基因组的自然突变，中国出现了低毒力的基因 II 型毒株。2021 年，在中国鉴定出了与 NH/P68 和 OURT88/3 相似的基因 I 型毒株。这些毒株比基因 II 型毒株表现出更低的毒力、更长的潜伏期和更强的传播能力，给疾病防控带来了新的挑战。更令人担忧的是，在 2021 年和 2022 年，中国发现了高致死性的基因 I 型和 II 型 ASFV 重组毒株。ASFV 是非洲猪瘟病毒科的唯一成员，是一种双链 DNA 病毒。其基因组大小在 170 到 190 千碱基对之间，编码 150 到 200 种病毒蛋白，其中包括 50 多种结构蛋白和 100 多种非结构蛋白。ASFV 基因组编码的蛋白质参与病毒的复制、病毒粒子组装、二十面体形成、免疫逃逸等过程。例如，B 型 DNA 聚合酶（pG1211R）、II 型 DNA 拓扑异构酶（pP1192R）、DNA 连接酶（pNP419L）、DNA 引发酶（pC962R）以及类组蛋白 DNA 结合蛋白（pA104R）已被证明可以独立于宿主细胞参与 ASFV 的复制。据报道，非结构蛋白 B602L 和跨膜蛋白 p17 参与病毒粒子组装或二十面体的形成。此外，不同的 ASFV 蛋白采用了多样的免疫逃逸策略。例如，据报道 pMGF505-7R、pMGF505-11R、pH240R 和 pE184L 通过靶向 STING 蛋白抑制由 cGAS-STING 通路介导的 IFN-β 的产生。研究表明，pI267L 会损害由 RNA 聚合酶 III-RIG-I（视黄酸诱导基因 I）激活的先天性抗病毒反应。另外，pMGF505-7R 和 pH240 通过靶向 NLRP3 炎症小体通路抑制白细胞介素 - 1β（IL-1β）的产生。尽管如此，近一半的病毒蛋白功能仍然未知，包括免疫调节蛋白，这给开发有效的疫苗和抗病毒药物带来了挑战。I 型干扰素（IFN-I）反应是宿主在病毒感染时的首要防御机制。它由模式识别受体（PRRs）识别病原体相关分子模式（PAMPs）所触发。模式识别受体是一类受体，包括视黄酸诱导基因 I 样受体（RLRs）、核苷酸结合寡聚化结构域（NOD 样）受体（NLRs）、Toll 样受体（TLRs）和环化 GMP-AMP 合成酶（cGAS）。最近，在病毒感染过程中，尤其是在单纯疱疹病毒 1 型（HSV-1）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒 1 型（KSHV-1）、ASFV 和伪狂犬病病毒（PRV）等 DNA 病毒感染时，对细胞质 DNA 传感器 cGAS 进行了专门研究。有趣的是，有报道称 RLR 信号通路也会被 DNA 病毒感染所激活。例如，单纯疱疹病毒 1 型（HSV-1）感染主要由黑色素瘤分化相关蛋白 5（MDA5）识别，从而激活 IFN-β 的产生。也有报道称，爱泼斯坦 - 巴尔病毒（EBV）编码的小 RNA 可被 RIG-I 识别，并在 EBV 感染的细胞中激活 I 型干扰素信号通路。此外，最近的一份报告显示，在 HSV-1 感染时，宿主来源的 RNA 会激活 RIG-I 介导的免疫反应。同样，宿主来源的 RNA 会激活 RLRs，以限制卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）的裂解性再激活。另一项研究证实，在 ASFV 感染时，RIG-I 和 MDA5 的 mRNA 水平会上调。ASFV 糖蛋白 I329L 也已被证明可以抑制双链 RNA（dsRNA）刺激下的 NF-κB 和干扰素调节因子 3（IRF3）的激活。然而，ASFV 感染激活 RLR 信号通路的机制以及调节 RLR 通路的特定 ASFV 蛋白在很大程度上仍不为人知。RIG-I 和 MDA5 属于识别 RNA 的细胞质病毒受体 RLR 家族，它们结构相似，并且具有相同的信号衔接蛋白 —— 线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）。RIG-I 识别带有 5'-ppp 帽的短双链 RNA，而 MDA5 识别更长的双链 RNA（dsRNA）的内部双链结构。当与双链 RNA 结合时，RIG-I/MDA5 会发生构象重排，诱导 RIG-I 或 MDA5 寡聚体的形成。随后，RIG-I 或 MDA5 寡聚体转移到线粒体并招募 MAVS，这会刺激 TANK 结合激酶 1（TBK1）和 IκB 激酶（IKK）的磷酸化。磷酸化的 TBK1 和 IKK 随后激活 IRF3 或 NF-κB 向细胞核的转位，从而启动干扰素的转录。作者的研究发现，pS183L 通过蛋白质间的相互作用抑制 MDA5 的寡聚化，从而对 RLR 介导的抗病毒信号产生负面影响。重要的是，pS183L 是一种此前未被深入研究过的 ASFV 蛋白。探索未被充分了解的 ASFV 蛋白在调节宿主 IFN 反应中的作用，将丰富人们对病毒感染的认识，并为疫苗开发提供新的靶点。非洲猪瘟病毒 pS183L 蛋白减弱 MDA5 介导的 IFN-β 激活众所周知，作为一种大型双链 DNA 病毒，非洲猪瘟病毒（ASFV）的感染会激活 cGAS-STING 信号通路，进而诱导 I 型干扰素反应。此外，有报告指出，在 ASFV 感染的早期阶段，视黄酸诱导基因 I（RIG-I）和黑色素瘤分化相关蛋白 5（MDA5）的转录被激活，但在后期阶段则受到抑制。最近，有研究报道称，从转染了富含腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）的 ASFV 基因组（ASFV-AT）的 PK15 细胞中提取的 RNA 能够激活 IFN-β 启动子。有趣的是，由 ASFV-AT 刺激产生的 IFN-β 可以被 RNA 聚合酶 III（RNA Pol-III）的特异性抑制剂（ML-60218）下调，这表明富含 ASFV-AT 的基因组能够激活由 RNA Pol-III-RIG-I 介导的先天免疫反应。然而，调节 MDA5 介导通路的 ASFV 蛋白仍然未知。作者使用双荧光素酶报告基因检测法筛选了几种 ASFV 编码的蛋白，以确定哪些 ASFV 蛋白能够调节 MDA5 介导的免疫反应。为此，将每种病毒蛋白与 IFN-β 荧光素酶报告基因以及 MDA5 刺激物一起转染。在这些蛋白中，鉴定出了 pS183L 蛋白（补充文件 1）。为了证实这一结果，在 293T 细胞和 PK15 细胞中，将 pGL3-Basic-IFN-β-Luc、pCMV-RL 与 MDA5/RIG-I/cGAS-STING 和 / 或 S183L 表达载体共转染，进行双荧光素酶报告基因检测。结果显示，pS183L 减弱了 MDA5 介导的 IFN-β 启动子活性（图 1A 和 D），但对 RIG-I 介导的（图 1B 和 E）或 cGAS-STING 介导的 IFN-β 启动子活性没有影响（图 1C 和 F）。因此，这些结果表明，pS183L 可能抑制 MDA5 介导的 IFN-β 信号通路。非洲猪瘟病毒 pS183L 蛋白抑制双链 RNA（dsRNA）触发的 IFN-β 产生RIG-I 识别短的合成双链 RNA（<0.5 千碱基对），而 MDA5 识别长的双链 RNA（0.5–7 千碱基对）。因此，高分子量（HMW）的聚肌胞苷酸（poly (I:C)，1.5–8 千碱基对），这种双链 RNA 的合成类似物，只会被 MDA5 识别，而 RIG-I 主要识别低分子量（LMW）的 poly (I:C)（0.2–1 千碱基对）。为了证实 pS183L 对 MDA5 介导的 IFN-β 产生的抑制作用，在 PK15 细胞中转染 S183L 或空载体后，使用低分子量和高分子量的 poly (I:C) 来激活 RIG-I 或 MDA5。然后通过实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）检测 IFN-β 的转录水平。结果显示，无论是否用 poly (I:C) 处理，pS183L 的过表达都会降低 IFN-β mRNA 的水平，在用高分子量 poly (I:C) 处理时尤其明显（图 2A）。随着 pS183L 表达量的增加，IFN-β mRNA 的水平持续下降（图 2B 和 C）。图2：pS183L抑制IFN-β、TNF-α和ISG54 mRNA的表达水平。当细胞内存在 pS183L 时，肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）和干扰素刺激基因 54（ISG54）的 mRNA 水平均下降（图 2D 和 E）。有趣的是，pS183L 对由低分子量和高分子量 poly (I:C) 激活的信号级联反应都有双重抑制作用。因此，作者研究了 RIG-I 和 MDA5 在低分子量和高分子量 poly (I:C) 刺激下的表达水平。研究结果表明，低分子量和高分子量的 poly (I:C) 均能诱导 MDA5 mRNA 和蛋白表达上调（补充文件 2）。正如先前的研究报道，这种上调在间充质干细胞（MSCs）中也有观察到。这一结果也可以解释为什么 pS183L 在抑制低分子量和高分子量 poly (I:C) 刺激的信号传导的同时，会特异性地下调由 MDA5 刺激诱导的 IFNβ 荧光素酶报告基因活性。此外，pS183L 也可能靶向 RIG-I，这可能会影响其对 RNA 的识别或涉及其他需要进一步研究的机制。总之，这些结果表明，pS183L 通过靶向 MDA5 介导的通路来调节 RLR 信号传导。非洲猪瘟病毒 pS183L 蛋白抑制 MDA5 与线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）之间的 RLR 信号传导病毒双链 RNA 与 RLR 家族受体结合会诱导 RIG-I 或 MDA5 发生构象变化和寡聚化，进而激活线粒体蛋白 MAVS 和细胞质激酶 TANK 结合激酶 1（TBK1），以刺激 IFN-β 信号传导。本研究使用信号级联反应中的不同因子来激活 RLR 信号通路，以确定 pS183L 的具体作用靶点，即 RIG-I、MDA5、MAVS 和 TBK1。双荧光素酶报告基因检测结果表明，pS183L 减弱了由 MDA5 激活的 IFN-β 启动子活性，但对由 RIG-I、MAVS 或 TBK1 激活的 IFN-β 启动子活性没有影响。这一发现在 PK15 细胞（图 3A）和 293T 细胞（图 3B）中均有观察到。因此，在 PK15 细胞中，用不同剂量的 S183L 质粒转染细胞，并在 RIG-I、MDA5 或 MAVS 刺激后，进一步确认这一结果。图3:pS183L在MDA5及下游、MAVS上游抑制IFN-β激活研究结果显示，pS183L 以剂量依赖的方式持续抑制 MDA5 介导的 IFN-β 启动子激活（图 3C），但对 RIG-I（图 3D）或 MAVS（图 3E）介导的 IFN-β 启动子激活没有抑制作用。这些结果表明，pS183L 在 MDA5 及下游、MAVS 上游抑制 IFN-β 的信号传导。免疫印迹结果显示，在 PK15 细胞中，当 pS183L 过表达时，poly (I:C) 刺激产生的磷酸化 TBK1（p-TBK1）、磷酸化 IRF3（p-IRF3）和磷酸化 IκBα（p-IκBα）水平降低，尤其是在用高分子量 poly (I:C) 处理时（图 3F）。用低分子量 poly (I:C) 或高分子量 poly (I:C) 刺激不同时间的结果表明，pS183L 对 RLR 信号通路的抑制作用具有时间依赖性（图 3G）。一般来说，pS183L 过表达后 p-TBK1 水平的下调表明，pS183L 的作用靶点位于 TBK1 的上游，这与双荧光素酶检测的结果一致（图 3A–E）。综上所述，这些结果表明，pS183L 在 MDA5 及下游、MAVS 上游抑制 MDA5 介导的 IFN-β 信号传导。非洲猪瘟病毒 pS183L 蛋白与 MDA5 相互作用RNA 传感器 MDA5 在检测到病毒 RNA 后会招募 MAVS，从而启动 I 型干扰素信号传导。考虑到 pS183L 在 MDA5 及下游、MAVS 上游抑制 IFN-β 的产生，作者假设 pS183L 的作用靶点是 MDA5。因此，进行了免疫共沉淀实验，通过在 293T 细胞中共转染表达 MDA5 和 S183L 的质粒，来分析 pS183L 与 MDA5 之间的蛋白质相互作用。实验结果显示，在使用 Flag 抗体免疫沉淀的 MDA5 蛋白复合物中检测到了带有 HA 标签的 S183L（图 4A）。相反，在使用 Flag 抗体免疫沉淀的 pS183L 蛋白复合物中检测到了带有 HA 标签的 MDA5（图 4B）。然而，在使用 MAVS 免疫沉淀的复合物中未检测到 pS183L（图 4C），并且在 pS183L 免疫沉淀的复合物中也没有 MAVS（图 4D）。随后，在 ASFV 感染的猪肺泡巨噬细胞（PAM）中进行免疫共沉淀实验，以验证 pS183L 与 MDA5 之间的相互作用。免疫共沉淀实验的结果表明，内源性 MDA5 存在于 pS183L 抗体免疫沉淀的复合物中（图 4E）。图4：pS183L与MDA5的半胱天冬酶激活和募集结构域（CARD）以及解旋酶结构域相互作用。此外，间接免疫荧光实验表明，在 293T 细胞中，pS183L 在细胞质和细胞核中均有定位，而 pS183L 与 MDA5 在细胞质中共定位（图 4F）。由于 pS183L 是一种未被充分研究的蛋白，除了免疫逃逸之外，它在 ASFV 感染过程中可能在细胞核中也发挥着一定作用。MDA5 由两个半胱天冬酶激活和募集结构域（CARD）、一个中央解旋酶结构域和一个 C 端结构域（CTD）组成。据报道，MDA5 的 CARD 结构域与 MAVS 相互作用并激活下游信号传导。解旋酶结构域负责依赖 RNA 的 ATP 水解，而 CTD 结构域能够结合双链 RNA。构建了带有 Flag 标签的 MDA5 截断体，包含 CARD、解旋酶或 CTD 结构域（图 4G），并进行免疫共沉淀实验，以分析 MDA5 的哪个结构域与 pS183L 相互作用。免疫共沉淀结果表明，在用 Flag 抗体沉淀的 MDA5 的 CARD 和解旋酶结构域中鉴定出了带有 HA 标签的 S183L（图 4H）。先前的报道表明，在未感染的细胞中，MDA5 的 CARD 结构域会发生磷酸化，而在病毒感染或双链 RNA 刺激下，会被蛋白磷酸酶 1α（PP1α）和蛋白磷酸酶 1γ（PP1γ）去磷酸化，会导致串联CARD结构域内结构变化。值得注意的是，MDA5 的 CARD 结构域与 K63 连接的多聚泛素链结合，从而激活免疫反应。此外，有报道称 MDA5 的 CARD 结构域与 MAVS 的 CARD 结构域相互作用，这表明 pS183L 可能靶向 MDA5 的 CARD 结构域，从而破坏 MDA5 与 MAVS 之间的相互作用，进一步抑制 IFN-β 的产生。作者进行了免疫共沉淀实验，以研究 pS183L 在 MDA5 与线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）相互作用中所起的作用。结果表明，在沉淀的带有 Flag 标签的 MDA5 蛋白复合物中，当 S183L 过表达时，带有 HA 标签的 MAVS 含量减少（图 5A）。此外，随着 pS183L 剂量的增加，带有 HA 标签的 MAVS 逐渐减少（图 5B）。一旦 MDA5 在细胞质中被病毒 RNA 激活，它就会与未锚定的赖氨酸 - 63（K63）多聚泛素链结合，并启动 MDA5 的寡聚化过程，以招募信号衔接蛋白 MAVS。因此，探究 pS183L 如何调节 MDA5 从而干扰对MAVS招募是有意义。在 293T 细胞中，通过共转染带有 Flag 标签的 MDA5 和泛素（UB），同时设置有或无 pS183L 表达的情况，来测定 MDA5 的 K63 多聚泛素化水平。研究结果显示，pS183L 的表达并不影响 MDA5 的 K63 多聚泛素化水平（图 5C）。为了进一步评估 pS183L 是否调节 MDA5 的寡聚化，进行了免疫共沉淀实验和半变性去污剂琼脂糖凝胶电泳（SDD-AGE）实验。结果表明，pS183L 破坏了带有 Flag 标签的 MDA5 和带有 HA 标签的 MDA5 之间的相互作用（图 5D），以及 MDA5 的寡聚化水平（图 5F）。此外，随着 pS183L 剂量的增加，带有 Flag 标签的 MDA5 和带有 HA 标签的 MDA5 之间的相互作用以及 MDA5 的寡聚化水平逐渐受到抑制（图 5E–G）。这些数据表明，非洲猪瘟病毒（ASFV）的 pS183L 蛋白通过与 MDA5 相互作用，随后阻断 MDA5 的寡聚化以及对 MAVS 的招募，从而减弱了 IFN-β 的产生。尽管非洲猪瘟（ASF）在一个世纪前就有报道，但至今仍没有安全有效的疫苗。非洲猪瘟病毒（ASFV）具有庞大的基因组和复杂的结构。它编码超过 150 种蛋白质，其中大多数通过不同的机制调节宿主的免疫反应，如细胞凋亡、自噬、炎症反应和 I 型干扰素调节等。然而，许多病毒免疫调节蛋白的功能仍然未知。本研究发现，pS183L，一种此前未被充分了解的 ASFV 病毒蛋白，通过靶向 MDA5 来负向调节先天免疫反应。重要的是，据作者所知，是首次有证据表明 ASFV 蛋白能够调节MDA5介导的IFN-β产生。作为一种 DNA 病毒，ASFV 与细胞质中感知 DNA 的 cGAS-STING 信号通路之间的相互作用已被广泛研究。这些研究结果表明，至少有 20 种 ASFV 编码的蛋白通过调节关键信号转导分子（包括 STING、TBK1、IRF3 等）的寡聚化、磷酸化、泛素化或降解来抑制 cGAS-STING 信号通路。有趣的是，研究发现，在 ASFV 感染的早期阶段，RNA 传感器 RIG-I 和 MDA5 的 mRNA 水平会升高，但随着病毒复制的进行而降低。这一结果表明，ASFV 感染过程中产生的 RNA 中间产物可能与 RIG-I 和 MDA5 介导的免疫反应相互作用。实际上，已有研究表明 ASFV 的 I267L 蛋白会抑制由 RNA 聚合酶 III-RIG-I 介导的先天免疫反应。尽管如此，目前还没有关于 ASFV 编码的蛋白调节 MDA5 介导的免疫信号传导的报道。然而，已有研究证明双链 DNA 病毒单纯疱疹病毒 1 型（HSV-1）的 US11 蛋白会与 MDA5 结合，破坏 MDA5-MAVS 复合物，并抑制 I 型干扰素的产生。作者发现，pS183L 不仅抑制 MDA5 介导的 IFN-β 启动子的激活，还会下调 PK15 细胞中由聚肌胞苷酸（poly (I:C)）诱导的 IFN-β 转录（图 1D 和图 2A）。因此，作者假设 pS183L 是 RLR 介导的抗病毒信号传导的潜在抑制剂。MDA5 是一种关键的细胞质双链 RNA 受体，对于传递危险信号以启动 IFN-β 的产生至关重要。在本研究中，作者证明了 pS183L 与 MDA5 的半胱天冬酶激活和募集结构域（CARD 结构域）相互作用（图 4A、B 和 G），但不与 MAVS 的 CARD 结构域相互作用（图 4C 和 D）。这一发现表明，pS183L 的 CARD 结构域与 MDA5 的 CARD 结构域有 19% 的相似性。研究结果还显示，pS183L 与 RIG-I 相互作用（补充文件 3），这表明 pS183L 与 RIG-I 之间可能存在未知的相互作用机制。一旦 MDA5 识别出病毒 RNA，它就会发生构象变化，暴露并使其 CARD 结构域多聚化，从而与 MAVS 的 CARD 结构域发生相互作用。因此，作者探究了 pS183L 在 MDA5 寡聚化过程中的作用。结果表明，pS183L 与 MDA5 的相互作用抑制了 MDA5 的寡聚化，进一步阻断了 MDA5 与 MAVS 之间的相互作用（图 5）。有趣的是，除了与 MDA5 的 CARD 结构域结合外，pS183L 还与 MDA5 的解旋酶结构域相互作用。一般来说，MDA5 通过其解旋酶结构域感知病毒 RNA，并通过 CARD 结构域向下游传递信号。因此，pS183L 与 MDA5 解旋酶结构域之间的相互作用可能会破坏病毒 RNA 的感知机制，并进一步阻断 MDA5 信号的激活。研究表明，RIG-I 和 MDA5 是病毒来源的病毒 RNA（尤其是甲型流感病毒、登革热病毒和寨卡病毒等 RNA 病毒）的主要传感器。有趣的是，在病毒感染时，宿主来源的 RNA 也会激活 RLR 信号通路。例如，HSV-1 感染会导致细胞非编码 RNA 的定位错误和暴露，这些 RNA 会与 RIG-I 相互作用并激活 RIG-I。同样，在卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）感染时，宿主 RNA 会被 RLR 识别，从而激活免疫反应。在 ASFV 感染时，RIG-I 和 MDA5 都会被激活，但其机制仍不清楚。最近，有研究报道，干扰素刺激基因效应因子 OAS1（2′, 5′- 寡腺苷酸合成酶基因 1）在 ASFV 感染后 24 小时会上调。研究还发现，OAS1 会通过调节核糖核酸酶 L（RNase L）对细胞 RNA 的切割来激活 RIG-I 和 MDA5 信号通路。然而，在 ASFV 感染的早期阶段 RIG-I 和 MDA5 是如何被刺激的，以及在后期阶段又是如何被下调的，目前仍不清楚。因此，在 ASFV 感染时，其他参与 RIG-I 或 MDA5 信号传导的宿主或病毒因子值得进一步探索。疫苗是预防和控制 ASFV 感染的最有效方法，但由于对许多毒力基因、病毒复制必需的关键基因以及调节宿主免疫反应的关键基因缺乏了解，疫苗的研发受到了阻碍。在作者之前的研究中，发现 pI73R 和 pCP312R 被确定为 Z-DNA 结合蛋白或单链 DNA 结合蛋白。此外，有报道称 I73R 是一个与毒力相关的基因，I73R 基因的缺失能为猪提供完全的同源保护。重要的是，作者还发现，由一个病毒复制必需基因编码的病毒核酸外切酶 pD345L，可以通过阻断 IKK 激酶活性来抑制 NF-κB 信号通路。此外，一些病毒复制必需基因，如 E301R 和 S273R，据报道会通过靶向 IRF3 或 IKK 复合物来抑制 IFN-β 的产生。这些发现可以部分解释为什么 ASFV 的减毒活毒株仍然保留免疫抑制活性。鉴于 pS183L 是首个靶向 MDA5 以下调 RLR 信号传导的 ASFV 蛋白，作者后续的研究将集中于构建 S183L 缺失的病毒，以评估其在体外和体内对病毒复制的作用。