为了提高企业研发和申报的规范性，建立科学规范的审评技术标准，助力国内rAAV产品的注册上市及产业高质量快速发展，进一步推动细胞和基因治疗产品的监管评价体系建设，我中心组织起草了《重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品申报上市药学共性问题与解答（征求意见稿）》。
我们诚挚地欢迎社会各界对征求意见稿提出宝贵意见和建议，并及时反馈给我们，以便后续完善。征求意见时限为自发布之日起一个月。请将您的反馈意见发到以下联系人的邮箱：
联系人：崔靖，金湘琬儿
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国家药品监督管理局药品审评中心
2025年4月8日
重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品申报上市药学共性问题与解答
（征求意见稿）
一、概述
重组腺相关病毒（Recombinant adeno-associated virus，rAAV）载体因其理化性质稳定，致病性、整合风险低，外源基因表达持久等显著优势，已成为基因治疗领域内重要的病毒载体之一。目前全球rAAV产品研发进展迅速，境内外开展临床试验的rAAV产品数量增长迅速，并且批准上市的rAAV产品数量逐渐增加。
rAAV产品创新程度高，生产工艺路线的复杂性导致生产工艺控制面临挑战，其质量研究和控制也存在诸多难点，上述问题对rAAV产品上市药学评价和后续审评带来一定挑战。本文根据现阶段的科学认知、行业实践和审评经验，对不同生产工艺的外源病毒因子风险控制策略、质量研究和质量标准制定过程中的共性问题提出一般性技术要求，以供申请人参考。
本文件仅反映监管部门当前对rAAV产品工艺和质量相关共性问题的监管考虑，随着科学技术的发展和监管知识经验的积累，相关内容将不断完善与更新。
二、常见问题与解答
1、外源病毒因子风险控制策略
问题：针对rAAV产品不同生产工艺开展外源病毒因子检测和控制的要求？
答复：
目前rAAV产品按照生产工艺中是否使用辅助病毒分为两类，一类是辅助病毒非依赖性产品，比如使用瞬时转染的细胞系，或使用稳定转化的细胞系，或通过重组杆状病毒等生产的rAAV产品；第二类是辅助病毒依赖性产品，比如生产工艺中需要使用辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒等）生产的rAAV产品。不同类型生产工艺，可能引入的病毒污染风险程度不同，因而对于外源病毒因子控制策略有所不同。因此，建议深入分析不同生产工艺病毒污染的潜在来源，并根据工艺特点、产品特点采用多阶段控制策略以控制整体风险。
采用瞬时转染细胞系或稳定转化细胞系生产的rAAV产品，病毒污染的风险可能来自细胞系（即生产用细胞），生产过程中使用的动物/人源材料，也可能来自生产过程中的偶然引入。因此，该生产工艺的rAAV产品外源病毒因子风险控制策略建议如下：a、建议按照ICH、《中国药典》等相关技术指南要求对主细胞库、工作细胞库、体外限传代次细胞进行全面检定，结合细胞来源、传代或改造历史、建库过程中使用的原材料情况等进行风险评估后确定外源病毒因子检测种类。b、对动物/人源材料，应结合其来源、生产工艺等开展特异性外源病毒检测，病毒检测种类应全面反映可能引入的外源病毒，检测方法应能有效检出特异性外源病毒。c、建议在适宜的生产步骤进行外源病毒的检测，作为工艺过程控制项目并设立合理的验收标准，通常选择的样品是未处理的病毒收获液，具体检测方法可参考ICH、《中国药典》等相关技术指南的要求。d、根据a-c控制策略和风险评估情况，如果在细胞库检定和未处理的病毒收获液中未发现除目标重组腺相关病毒产品以外的其他病毒、病毒样颗粒（Virus-like particles, VLP）或逆转录病毒样颗粒（Retrovirus-like particle, RVLP），则建议使用非特异“模型”病毒开展病毒去除/灭活验证，以评估现有生产工艺步骤对非特异性“模型”病毒的清除能力。e、根据a-d检测结果和风险评估认为外源病毒因子污染风险可控，则无需评估每个剂量中病毒颗粒量，也无需对原液/纯化后产品进行外源病毒检测。
采用杆状病毒-昆虫细胞系生产的rAAV产品，病毒污染的风险可能来自包装/生产用细胞以及病毒种子批，生产过程中使用的动物/人源材料，也可能来自生产过程中偶然的引入。因此，该生产工艺的rAAV产品外源病毒因子风险控制策略建议如下：a、包装/生产用细胞、动物/人源材料外源病毒的控制在参见瞬时转染细胞系或稳定转化细胞系生产的rAAV产品 “a-b”所述要求的基础上，还应考虑对昆虫细胞库增加弹状病毒、螺原体等项目的检定。b、病毒种子批的检定项目应符合《中国药典》或其他通行技术指导原则的相关要求，并根据病毒种子批建立的特定情况，以及对病毒种子相关特征的评估设定相应的检定项目。由于重组杆状病毒本身可能对外源病毒因子传统检测方法（体外法、体内法）产生干扰，建议对病毒种子中和后再进行检测，如不能被充分中和，可在生产中设置对照细胞，采用对照细胞进行外源病毒因子检测。c、建议在适宜的生产步骤进行外源病毒的检测，作为工艺过程控制项目并设立合理的验收标准。检测样品一般建议采用未处理的病毒收获液，其检测要求同病毒种子批。同时，应在上市阶段提供至少3批次未处理病毒收获液的杆状病毒和弹状病毒定量检测结果，用于评估生产工艺对上述病毒的清除率。d、由于包装/生产用细胞中可能含有弹状病毒，并且生产体系中引入了重组杆状病毒，因此，应考虑在生产工艺中设立病毒去除/灭活单元，并参考ICH Q5A的一般原则开展病毒去除/灭活验证研究。原则上，病毒清除验证研究应使用已鉴定的病毒，如果不能使用已鉴定的病毒，则应使用“相关”病毒或特异性“模型”病毒开展研究，如杆状病毒和水泡性口炎病毒（可代表sf9细胞系中内源性弹状病毒），应说明病毒选择的依据。建议评价特定的工艺步骤对特异性或非特异性“模型”病毒的去除/灭活效果，并评估整个生产工艺步骤对特异性“模型”病毒的总体清除效果。常见的病毒去除/灭活步骤通常包括溶剂/去污剂处理、低pH孵育、柱层析、纳滤等，建议基于风险评估考虑设立多种不同原理的病毒去除/灭活工艺步骤。e、对于原液/纯化后产品的外源病毒检测和控制，如果基于a-c全面检测和控制，以及d已证明工艺步骤对相关病毒或特异性“模型”病毒具有稳健的清除能力和效果，上市申请时，应提供至少3批次中试规模或商业化生产规模原液/纯化后产品的残留重组杆状病毒和弹状病毒检测结果的代表性数据，检测方法应选择特异性和灵敏度较高的合适方法。否则，应对每个批次原液/纯化后产品进行残留杆状病毒或弹状病毒的检测。
采用腺病毒、单纯疱疹病毒等辅助病毒生产的rAAV产品，病毒污染的风险可能来自包装/生产用细胞以及病毒种子批，生产过程中使用的动物/人源材料，也可能来自生产过程中偶然的引入。因此，该生产工艺的rAAV产品外源病毒因子风险控制策略建议如下：a、包装/生产用细胞、动物/人源材料外源病毒的控制参见瞬时转染细胞系或稳定转化细胞系生产的rAAV产品 “a-b”所述要求。b、病毒种子批的检定项目应符合《中国药典》或其他通行技术指导原则的相关要求，并根据病毒种子批建立的特定情况，以及对病毒种子相关特征的评估设定相应的检定项目。由于辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒等）本身可能对外源病毒因子传统检测方法（体外法、体内法）产生干扰，建议对病毒种子中和后再进行检测，如不能被充分中和，可在生产中设置对照细胞，采用对照细胞进行外源病毒因子检测。c、建议在适宜的生产步骤进行外源病毒的检测，作为工艺过程控制项目并设立合理的验收标准。检测样品一般建议采用未处理的病毒收获液，其检测要求同病毒种子批。同时，应在上市阶段提供至少3批次未处理病毒收获液的辅助病毒定量检测结果，用于评估生产工艺对辅助病毒的清除率。d、由于生产过程中使用了辅助病毒，因此，应考虑在生产工艺中设立病毒去除/灭活单元，并参考ICH Q5A的一般原则开展病毒去除/灭活验证研究。原则上，病毒清除验证研究应使用已鉴定的病毒，如果不能使用已鉴定的病毒，则应使用“相关”病毒或特异性“模型”病毒开展研究，如腺病毒、疱疹病毒等，应说明病毒选择的依据。建议评价特定的工艺步骤对特异性或非特异性“模型”病毒的去除/灭活效果，并评估整个生产工艺步骤对特异性“模型”病毒的总体清除效果。常见的病毒去除/灭活步骤通常包括溶剂/去污剂处理、低pH孵育、柱层析、纳滤等，建议基于风险评估考虑设立多种不同原理的病毒去除/灭活工艺步骤。e、对于原液/纯化后产品的外源病毒检测和控制，如果基于a-c全面检测和控制，以及d已证明工艺步骤对相关病毒或特异性模型病毒有稳健的清除能力和效果，则建议上市申请时，应提供至少3批次中试规模或商业化生产规模原液/纯化后产品的残留辅助病毒检测结果的代表性数据，检测方法应选择特异性高和灵敏度高的合适方法。否则，应对每个批次的原液/纯化后产品进行残留辅助病毒的检测。
2、纯度检测方法选择和标准限度制定的一般考虑
问题（1）：rAAV产品纯度检测时，对使用CE-SDS方法或SDS-PAGE方法选择的一般考虑
答复：
CE-SDS方法和SDS-PAGE方法均可用于rAAV产品的纯度研究，以上方法是基于在变性条件下蛋白与SDS结合形成带负电的蛋白质-SDS复合物，这些复合物在电场作用下根据分子量大小进行分离，是目前蛋白质纯度检测比较常见的方法。其中， CE-SDS方法在分离度、精密度、稳健性等方面优于SDS-PAGE方法，随着技术的不断发展和进步，新的更优的检测方法也可能逐步应用，因此，鼓励优先采用灵敏度和准确度较高的检测方法用于产品纯度检测。如在临床期间发生方法的变更，建议根据方法变更情况评估综合风险，开展必要的变更后方法的全面验证并对变更前后方法进行桥接研究，应确保变更后方法对产品质量的控制能力与变更前方法相当或更优。变更前后方法检测结果存在定差异时，建议尽可能采用变更后方法对既往临床试验用代表性批次进行重新检测，积累批次数据，为质量标准制定提供依据。
问题（2）： rAAV产品单体和聚集体含量是否必须纳入质量标准？
答复：
由于早期研发阶段对产品的认知尚浅，建议尽可能采用多种技术手段或方法对产品开展全面的表征研究。目前用于检测rAAV产品单体和聚集体的方法较多，比如SEC-HPLC/MALS、AUC、DLS等，考虑到单体和聚集体含量可反映生产工艺的稳健性和产品质量特性，因此，建议开展rAAV产品单体和聚集体的质量研究，并纳入质量标准。临床试验阶段建议持续收集多个批次rAAV产品单体和聚集体的质量检测数据，以及稳定性期考察数据的变化情况，合理拟定单体和聚集体的标准限度。
问题（3）：rAAV产品特征性衣壳蛋白（VP1、VP2、VP3）控制策略的一般考虑
答复：
对于rAAV产品，VP1、VP2、VP3含量差异较大，通常VP1和VP2含量较低，VP3含量较高，其中某些血清型的rAAV产品含有部分VP3分子变体，因此，对于特征性衣壳蛋白（VP1、VP2、VP3、）以及VP3分子变体的控制策略，建议结合产品特点、分子设计、受工艺影响的程度以及对安全性、有效性、质量可控性的影响程度综合考虑。必要时，除了对rAAV产品VP1+VP2+VP3总量进行控制外，还需对VP3分子变体含量进行监测，根据其对病毒结构或功能影响的风险评估进行单独控制。
3、基因组滴度检测方法选择和不同方法桥接对比研究的一般考虑
问题（1）：rAAV产品基因组滴度检测时，使用qPCR方法或d(d)PCR方法选择的一般考虑
答复：
d(d)PCR方法相比qPCR方法具有更好的重复性和稳定性，且该方法是对基因拷贝数的绝对定量，不依赖标准品和标准曲线，因此，该方法具有较好的灵敏度和准确度。随着技术的不断发展和进步，新的更优的检测方法也可能逐步应用，因此，鼓励优先采用灵敏度和准确度较高的检测方法用于产品基因组滴度检测。
问题（2）：qPCR方法和d(d)PCR方法检测结果存在的差异？如何进行桥接和结果校准？
答复：
随着产品临床试验进展的不断推进，可能会发生基因组滴度检测方法的变更，鉴于基因组滴度对于确保产品剂量准确性及安全性至关重要，如拟在临床试验期间变更检测方法，建议尽可能在早期临床试验阶段进行方法变更，同时根据方法变更情况综合评估风险，开展必要的变更后方法的全面验证并对变更前后方法进行桥接研究，应确保变更后方法对产品质量的控制能力与变更前方法相当或更优。由于qPCR方法和d(d)PCR方法在检测原理、引物设计等方面存在差异，不同检测方法的检测结果可能存在差异，建议尽可能采用变更后方法对既往临床试验用代表性批次进行重新检测，积累批次数据，为质量标准制定提供依据。
4、空壳率检测方法选择和标准限度制定的一般考虑
问题（1）：目前rAAV产品常见的空壳率检测方法包括AUC方法、IE-HPLC方法、SEC-MALS方法等，对于不同检测方法作为表征研究或质量标准的一般考虑
答复：
IE-HPLC方法和SEC-MALS方法平台成熟，分析速度快，通量高，但不能完全区分部分包装病毒和实心病毒。相比IE-HPLC、SEC-MALS方法，AUC法对完整包装病毒、部分包装病毒和空壳病毒的分离效果方面较好，实测空壳率与理论空壳率差异较小，在行业内也得到比较广泛的认可和应用。随着技术的不断发展和进步，新的更优的检测方法也可能逐步应用，因此，鼓励优先采用灵敏度和准确度较高的检测方法用于空壳率检测和控制。
问题（2）：对于rAAV产品空壳率标准限度制定的一般考虑
对于空壳率标准限度的拟定，建议基于产品特点、生产工艺和既往历史批次检测数据、给药方式和剂量，以及与临床安全性和有效性的相关性等因素综合考虑，应特别关注空壳率检测方法变更情况以及变更前后检测数据的桥接研究情况，基于以上整体因素考虑开展充分的研究，并基于充分研究数据证明标准限度制定的合理性。
5、效价检测方法的一般考虑
答复：
效价作为反映产品生物学活性的关键质量属性，不仅包括检测产品本身的效价，如感染滴度，还应考虑其递送基因表达产物的效价，如表达产物的生物学活性。在早期临床试验阶段，建议根据产品设计和对产品作用机制的理解，初步建立生物学活性分析方法，如对外源目的基因表达产物正确性的确认，目的基因的表达水平，表达产物的生物学活性等研究。由于作用机制的差异，对于开发难度较大的表达产物的生物学活性分析方法，可考虑在临床试验期间逐步建立并完善，但建议在其他研究水平进行质量控制（如表达量等），必要时可与监管机构进行沟通。随着临床试验不断推进，建议持续完善效价相关的关键质量属性的确认和效价控制策略，并尽可能建立关键质量属性与效价之间的相关性。产品上市申请阶段，效价标准限度应基于生产经验以及产品开发和临床研究批次积累的数据进行设定，综合考虑关键临床试验批次数据、方法变异度以及稳定性期间的变化情况进行修订和完善。
通常情况下，不同rAAV产品发挥作用的机制可能不同，并且一些产品可能含有多种活性成分和/或多种生物学活性，对于某些产品可能需要测定每种活性成分的浓度和效价，某些产品可能采用一种生物学测定方法可以评估或反映所有活性成分效价。因此，不同产品效价检测方法应结合具体情况具体分析。
采用生物学测定方法作为效价检测方法可能受多种因素影响，比如不同仪器之间变异性影响，不同分析人员变异性影响，以及生物学测定方法中使用的检定用细胞、生物试剂等变异性影响。因此，建议尽可能识别可能影响效价检测方法的潜在影响因素，并充分评估这些因素对方法准确度、精密度等影响。同时，为进一步降低上述因素变异性对效价测定结果的影响，可考虑建立对照品/标准品，或者对每个待测样品进行多次独立分析运行并报告平均值进行报告。
如果产品在研发期间发生变更，应结合变更内容、变更程度及变更风险提供充分的风险评估和研究数据，以证明该变更不会对产品的效价产生不利影响。
6、可复制型腺病毒（Replication Competent AAV, rcAAV）检测方法和标准限度制定的一般考虑
问题（1）：rcAAV检测方法选择的考虑？
答复：
rAAV产品生产过程中，由于载体基因组、Rep/Cap基因以及ITR序列可能发生同源和/或非同源重组，可能会形成具有复制能力和潜在感染性的野生型病毒，即复制型腺相关病毒（Replication Competent AAV, rcAAV）。研究显示， rcAAV在辅助病毒（例如腺病毒Ad5）存在条件下可以复制扩增，可能影响转基因表达或诱导机体产生免疫反应，是一种具有潜在风险的工艺相关杂质。因此，需要对rAAV产品进行rcAAV的检测。为了提高检测方法灵敏度，建议采用细胞培养法与PCR相结合的方法。
问题（2）：rcAAV检测方法中阳性病毒选择的考虑？
答复：
对于rcAAV检测方法中阳性病毒的选择，建议选择与产品血清型一致的阳性病毒作为对照病毒。阳性对照病毒可以购买商业化相应血清型阳性病毒，也可以自行构建，但无论通过何种途径获得，均应在申报资料中提供阳性病毒的来源、制备工艺、主要功能元件及感染滴度标定的详细资料，并关注阳性病毒在贮存期间的滴度稳定性。
问题（3）：rcAAV检测方法中共培养细胞选择的考虑？
答复：
对于培养法中所使用共培养细胞的选择，考虑到不同血清型病毒对不同细胞的感染特性或感染能力不同，鼓励尽可能基于产品特性筛选易感的细胞系，其可以通过商业化购买，也可以自行构建，但无论通过何种途径获得，均应关注细胞的传代方式、培养条件等对方法检测灵敏度的影响。
共培养细胞应按照《中国药典》检定用细胞相关要求提供全面的研究资料，如合法来源证明性文件、细胞库建库过程资料、细胞库检定研究资料等。
问题（4）：rcAAV标准限度如何制定？
答复：
rcAAV标准限度应在上市阶段结合方法验证结果、批次数据积累、临床安全性和有效性等情况设定合理的标准限度。
7、残留DNA片段大小控制要求
问题（1）：rAAV产品中残留DNA大小分布是否需要纳入质量标准？
答复：
对于残留DNA片段大小的检测与控制，建议在临床试验阶段对DNA片段大小进行持续监测，积累多个批次数据，并关注不同DNA片段大小分布变化情况。同时，根据临床期间积累数据情况开展充分的安全性评估，基于积累的数据和安全性评估情况综合考虑，可不强制要求纳入质量标准。
问题（2）：rAAV产品中残留DNA片段大小达不到现有指导原则＜200bp要求，如何考虑？
答复：
从产品安全性风险的角度考虑，建议通过工艺开发和优化尽量降低残留DNA片段大小，但考虑到目前大部分rAAV产品在现有的工艺水平下可能难以达到残留DNA大小＜200bp的要求，建议结合具体品种类型，以及现有工艺对残留DNA片段的去除能力等具体分析，通过开展更加充分的研究和安全性评估数据证明残留DNA片段大小内控标准限度拟定的合理性。同时，基于提高产品质量，降低潜在安全性风险工艺相关杂质水平的考虑，鼓励申请人通过不断优化生产工艺尽可能降低>200bp残留DNA片段的比例。
三、参考文献
1. ICH Q5A(R2). Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human or animal origin. 2023.
2. NMPA. 体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则. 2022.
3. NMPA. 重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则. 2023.
4. 国家药典委员会.《中华人民共和国药典》(2020年版). 2020.
5. FDA. Potency tests for cellular and gene therapy products. 2011.
6. FDA. Potency assurance for cellular and gene therapy products (draft guidance for industry). 2023.