耶鲁大学医学院研究：无病毒血症的HIV感染老年人免疫衰老的T细胞谱和基因特征，有这些改变...

衰老对免疫系统的多重影响，不仅改变了其组成结构，还可能提升感染、恶性肿瘤及炎症性疾病的风险。随着全球60岁以上人口的显著增长，衰老对免疫相关疾病的影响愈发显著。在免疫系统中，与年龄相关的显著变化包括幼稚与记忆T细胞比例的改变，特别是衰老T细胞如IL-7受体阿尔法低（IL-7Rα^low）效应记忆（EM）CD8 + T细胞的增加，以及慢性低级炎症状态的加剧，其中炎症分子如IL-6的循环水平也随之上升。

联合抗逆转录病毒疗法（ART）的推广，通过抑制病毒复制和提升CD4 + T细胞计数，显著延长了艾滋病毒感染者的预期寿命。据统计，美国过半的艾滋病毒感染者已年过五十，预计到2030年，这一比例将攀升至70%。然而，研究显示，即便在控制了ART、吸烟、药物滥用及肝炎病毒感染等因素后，艾滋病毒感染者与未感染者的预期寿命仍存在六年差距，这可能与非获得性免疫缺陷综合征（非艾滋病）相关的合并症，如心血管疾病和恶性肿瘤有关。特别值得注意的是，接受ART治疗的艾滋病毒感染者在21岁时的无合并症预期年数较未感染者缩短了9.5年，凸显了预防艾滋病毒感染者合并症的紧迫性。

免疫衰老样变化，包括记忆CD8+ T细胞的扩展，以及IL-6等循环炎症分子水平的升高，已在无临床可检测病毒血症的年轻艾滋病毒感染者中被报道，这进一步支持了艾滋病毒加速免疫衰老的观点。尽管有多项研究探讨了艾滋病毒感染者的T细胞，包括接受ART治疗的65岁以上老年人，但关于免疫亚群的详细表型特征仍显不足。因此，艾滋病毒感染是否及如何影响老年艾滋病毒感染者的免疫衰老状态，目前尚无定论。

耶鲁大学医学院发起了一项研究，通过对外周血单核细胞（PBMCs）中一组衰老相关基因的分析，以及对无病毒血症的老年健康艾滋病毒感染者（年龄≥ 65岁）进行的多维T细胞分析，研究探讨了艾滋病毒感染对免疫衰老的影响。研究结果显示，接受ART且无病毒血症的老年艾滋病毒感染者的PBMCs中，年龄相关免疫改变水平显著增加，包括衰老相关基因表达和具有衰老特征的T细胞亚群，这表明尽管病毒血症得到控制，老年艾滋病毒感染者中可能的衰老驱动因素依然存在。结果发表于Aging Cell期刊。

doi:10.1111/acel.13702

研究从65岁及以上的三组受试者中获取外周血：HIV感染者（n=27）、未感染HIV者（n=29）和虚弱者（n=23）。3组平均年龄分别为68.2岁、75.7岁和83.9岁，3组之间的性别分布没有差异（表1）。HIV感染者的CD4+ T细胞计数平均为738.8/mm³，感染年限为24.1年。虚弱状态根据FRAIL量表评估，虚弱、虚弱前和健康状况分别用评分3-5、1-2和0来定义，23名虚弱受试者中19名为虚弱，4名为虚弱前。研究通过分析外周血单核细胞中的衰老相关基因和多维CyTOF分析CD4+和CD8+ T细胞亚群，探讨老年艾滋病毒感染者、未感染者和虚弱个体的差异。

表1 研究受试者的特征

‡对于CyTOS分析，研究了来自各组的12名（HIV+）、15名（HIV-）和13名（虚弱）受试者。

¶ 27名受试者中有8名有静脉注射（IV）药物使用史。

*通过单因素方差分析; HIV感染与未感染HIV，通过事后检验P = 0.001; HIV感染与脆弱，通过事后检验P < 0.001。

**皮尔森卡方检验

老年HIV感染者的外周血单核细胞（PBMCs）中，衰老相关基因（如CX3CR1）的表达显著上调。这些基因与IL-7受体低效应记忆（IL-7Rα^low EM）CD8+ T细胞密切相关，该细胞群在年龄增长过程中呈现扩增趋势。IL-7Rα^low EM CD8+ T细胞亚群不仅表达与衰老、细胞毒性和炎症相关的分子（如CD57、穿孔素和CX3CR1），还伴随表达CD161和CXCR3的记忆CD4+ T细胞数量增加，这些分子与具有复制能力的HIV-1携带细胞密切相关。综上所述，尽管接受抗逆转录病毒治疗（ART）且病毒血症已得到临床控制，老年HIV感染者的PBMCs中仍表现出显著的年龄相关免疫改变，提示HIV感染对老年患者的衰老进程具有持续性影响。

幼稚与记忆T细胞比例的衰老相关变化，包括IL-7Rα^lowEM CD8+ T细胞的扩展，已通过全球基因表达谱的荟萃分析得到证实。研究之前的研究发现，IL-7Rα^lowEM CD8+ T细胞中存在差异表达的231个基因，这些基因与年龄相关变化显著相关，进一步支持了IL-7Rα^lowEM CD8+ T细胞扩张与非HIV感染者外周血细胞基因表达谱年龄相关变化之间的关联。

在未接受ART治疗的HIV感染者中，CD8+ T细胞上IL-7Rα的表达下降，而ART部分恢复了这一变化。研究的研究进一步探讨了在接受ART治疗且无病毒血症的老年HIV感染者中，外周血细胞中IL-7Rα^lowEM CD8+ T细胞的衰老标志基因表达是否增加，特别是九个具有高z评分及IL-7Rα^low与IL-7Rα^highEM CD8+ T细胞倍数变化的基因。

研究还纳入了老年虚弱者，以探讨老年HIV感染者是否会出现类似于老年虚弱者生理储备丧失的免疫变化。五种基因的表达水平，包括编码趋化因子受体CX3CR1、钙敏感分子SYT11、转化生长因子β受体3、细胞毒性细胞分泌分子FGFBP2及细胞毒性分子调节因子NKG7，在老年HIV感染者中较未感染HIV及虚弱的老年人有所增加（图1）。

图1 接受抗逆转录病毒治疗（ART）且未出现病毒血症的老年HIV感染者的PBMCs中与衰老和IL-7Rα^low效应记忆（EM）CD8 + T细胞相关的基因表达增加 

qPCR分析接受ART但未出现病毒血症的老年HIV感染者（HIV+）、未感染HIV（HIV-）和虚弱个体（所有年龄均≥65岁）的PBMCs中指示基因。

条表示手段。p值通过单向方差分析和Holm-Sidak事后检验获得

研究针对65岁及以上的老年人群，发现HIV感染者、未感染者和虚弱者的平均年龄和种族比例存在显著差异。为控制这些变量，研究采用了线性模型分析基因表达水平。结果显示，HIV感染者中CX3CR1、SYT11和TGFBR3的表达显著增加，而FGFBP2和NKG7的表达水平增加也接近统计学意义水平（分别为p = 0.100和0.114，表2）。

表2 老年HIV感染者免疫细胞变化总结

*p值对于所有比较，除PBMCs中的 ** 群组5外的p值均≤0.05（p = 0.0607）

与未感染HIV的老年人相比，老年虚弱者的GZMB和OSBPL5表达下降。此外基因表达与HIV感染年数、CD4+ T细胞计数或静脉注射药物使用史无显著关联。研究还发现，老年感染HIV、未感染HIV和虚弱个体中IL-7Rα^lowEM CD8 + T细胞的频率相似（图2），这表明老年感染HIV的个体中IL-7Rα^lowEM CD8 + T细胞衰老标志基因表达增加与总IL-7Rα^lowEM CD8 + T细胞的比例无关。

图2在接受抗逆转录病毒治疗（ART）但未出现病毒血症的老年HIV感染者、未感染HIV的人和虚弱者中，IL-7Rα^low效应记忆（EM）CD8 + T细胞的频率相似

（a，b）对接受ART治疗但未出现病毒血症的老年HIV感染者（HIV+）、未感染HIV（HIV-）和虚弱个体（年龄≥65岁）的PBMCs中的幼稚（CD45RA + MCR7+）、中央记忆（CM，CD45RA-MCR7+）和效应记忆（EM，CD45RA +/-MCR7-）CD8 + T细胞进行流式细胞术分析。(a)单个细胞亚群频率的代表性点图和（b）散点图。（c，d）相同受试者EM CD8 + T细胞中IL-7Rα^high和^low细胞的流式细胞术分析。(c)EM CD8 + T细胞中IL-7Rα^high和^low细胞频率的代表性图表和（b）散点图。

p值通过单向方差分析获得。N.S.表示不显着（p值>0.05）

研究探讨了在未出现病毒血症的老年HIV感染者中，IL-7Rα^lowEM CD8+ T细胞的衰老标志基因表达增加是否与这些细胞亚群比例的变化相关。研究发现，尽管老年HIV感染者与未感染HIV者的平均年龄相似，但他们的免疫细胞亚群比例发生了变化，特别是T细胞和树枝状细胞。进一步分析显示，老年HIV感染者的CD4+和CD8+ T细胞中，与T细胞分化相关的分子（如CD45RA和CD28）表达降低，而T细胞抑制分子PD1和NK细胞相关分子CD161的表达增加。这些变化可能与慢性疾病（包括HIV感染）相关，但老年HIV感染者与虚弱者在这些分子的表达上无显著差异（图3）。

图3 在接受抗逆转录病毒治疗（ART）时，与T细胞分化和CD4+和CD8 + T细胞衰竭相关的分子的表达水平发生了变化，但没有病毒血症

（a，b）通过CD4 + T和CD8 + T细胞中的几何平均金属强度（GMMI）测量的单个分子的表达水平，该细胞是根据接受ART治疗但未出现病毒血症的老年HIV感染（HIV+）（n = 12）、HIV未感染（HIV-，n = 15）和虚弱（n = 13）个体的获得CyTOS数据门控的。如图3所示。

条和误差条分别表示平均值±扫描电子显微镜。p值通过单向方差分析和Holm-Sidak事后检验获得。

*p <0.05，单因素方差分析。§p < 0.05 HIV+ vs. HIV-，‡ p < 0.05 HIV+ vs.虚弱，⁋p < 0.05 HIV-vs.虚弱 通过事后分析。

（c，d）热图，显示基于单个分子的GMPI的z评分对分子和研究对象进行的无偏见分层集群分析的结果

相比之下，与未感染HIV的老年个体和虚弱的个体相比，老年感染HIV的个体中CD8 + T细胞的CX3CR1表达水平增加（图3b）。值得注意的是，CX3CR1由细胞毒性和炎症性IL-7Rα^lowEM CD8 + T细胞高度表达，这些细胞随着年龄的增长而扩张。研究测试了研究对象是否可以根据表达水平进行聚集（即，使用无偏见的生物化学方法对单个分子进行GMMI。根据CD4 + T细胞而非CD8 + T细胞表达这些分子，老年感染HIV的个体主要聚集在一起（图3c、d）。

老年HIV感染者的CD4+与CD8 + T细胞比例低于未感染HIV的老年人（图3e，平均值± SD，HIV + 1.20 ± 0.74 vs HIV- 2.53 ± 1.70，p = 0.017），这与之前研究的结果一致，该研究表明接受ART治疗的HIV感染者中CD4与CD8 T细胞比率较低。

研究结果表明，HIV对老年人T细胞免疫分子表达的影响对于细胞和分子类型具有特异性，尽管已知大多数受影响的分子与T细胞激活、衰竭和衰老有关。

研究分析了老年HIV感染者中CD4+和CD8+ T细胞亚群的变化（表2）。结果显示，老年HIV感染者中具有记忆T细胞特征的CD4+ T细胞（CD45RA^lowCCR7^low）频率增加，这些细胞CD27表达低，但PD-1和CD25表达中等，即使在无病毒血症情况下，激活的记忆CD4+ T细胞也可能扩大。

老年HIV感染者的CD4+ T细胞向CD161^highCXCR5intermediatePD-1^high细胞转变，这与HIV-1的复制能力相关，可能对ART治疗产生不利影响。在CD8+ T细胞方面，老年HIV感染者中晚期分化和细胞毒性CD8+ T细胞频率增加，这些细胞IL-7Rα、CD27和CD28表达低，但T-bet、CD45RA、CD56、CD57、穿孔素、颗粒酶B、2B4和CX3CR1表达高（图4）。

图4 多维聚集分析揭示了CD4+和CD8 + T细胞亚群在接受抗逆转录病毒治疗（ART）时没有病毒血症的老年HIV感染者中发生了变化

对来自图4（a，b）所示的采集CyTOS数据的老年HIV感染者（HIV+，n = 12）、未感染HIV（HIV-，n = 15）和虚弱（n = 13）的预门控CD4+和CD8 + T细胞进行了T-SNE、PhenoShape聚集和元集群（k参数设置为15）分析。T-SNE图分别显示了14个和12个CD4+和CD8 + T细胞群的景观。数字和匹配的色点表示单个细胞子集。（c，d）热图，分别显示a和b中显示的CD4+（c）和CD8 + T细胞（d）的各个簇的簇的频率（Y轴）和指示分子的平均表达水平（X轴）。（e，f）显示老年HIV感染者、未感染HIV者和虚弱个体中CD4+（E）和CD8 + T细胞（f）个体群的频率的图表。

条和误差条分别表示平均值±扫描电子显微镜。p值通过单向方差分析和Holm-Sidak事后检验获得。

*p< 0.05，单因素方差分析。§ p< 0.05 HIV+ vs. HIV-，‡p < 0.05 HIV+ vs.虚弱， ⁋p < 0.05 HIV- vs.虚弱，通过事后分析

随后，研究通过分析记忆性CD4+和CD8 + T细胞单个分子的表达水平，以及根据MCR7和CD45RA表达对CD45RA-记忆性CD4+和MCR7-CD45RA +/-EM CD8 + T细胞进行门控后对这些细胞进行聚集，进一步探讨了HIV对老年人T细胞的可能影响。与老年未感染HIV和虚弱群体相比，老年HIV感染者的此类记忆细胞中，总CD4 + T和CD8 + T细胞发生变化的大多数分子的表达水平也发生了变化（图5a和6a），这表明老年HIV感染者中CD4+和CD8+记忆T细胞亚群的比例可能发生变化。事实上，与未感染HIV的对照组相比，老年HIV感染者表达高水平CD38、CD62L、CD27和CD28的早期分化记忆CD4 + T细胞的频率降低（图5 b-d，群2）而与两个对照组相比，老年HIV感染者中晚分化CD27^lowCD28^high和CD161^highPD-1^high记忆CD4 + T细胞的频率增加（图5 b-d）。

图5 多维聚集分析揭示了记忆CD4 + T细胞亚群，这些亚群在接受抗逆转录病毒治疗（ART）时没有病毒血症的老年HIV感染者中发生了变化 

(a)通过记忆CD4 + T细胞中的几何平均金属强度（GMPI）测量的单个分子的表达水平，该细胞是根据接受ART治疗但没有病毒血症的老年HIV感染者（HIV+，n = 12）、未感染HIV（HIV-，n = 15）和虚弱（n = 13）个体的获得CyTOS数据门控的，如图4所示。

(b-d)基于a中X轴标记指示的分子的表达，对记忆CD4 + T细胞进行T-SNE、PhenoShape聚集和元聚集（k参数设置为15）分析。

(b)T-SNE图显示了12个集群的景观。数字和匹配的色点表示单个细胞子集。

(c)热图显示簇的频率（Y轴）和各个簇的指示分子的平均表达水平（X轴）。

(d)图表显示了老年感染HIV、未感染HIV和虚弱个体中个体聚集的频率。

条和误差条分别表示平均值±扫描电子显微镜。p值通过单向方差分析和Holm-Sidak事后检验获得。*p< 0.05，单因素方差分析。§ p< 0.05 HIV+ vs. HIV-，‡ p < 0.05 HIV+ vs.虚弱，⁋p < 0.05 HIV- vs.虚弱，通过事后分析

最近的一项研究报告称，与CD161-CD4 + T细胞相比，CD161 + CD4 + T细胞携带更多HIV-1 DNA和复制能力病毒。在分析EM CD8 + T细胞时，老年HIV感染者的两个IL-7RαlowEM CD8 + T细胞亚群的频率增加，这些细胞亚群具有相似的衰老和细胞毒性表型，包括高水平的CD57、穿孔素、颗粒酶B、CX3CR1和T-bet，除了在各自亚群上高度表达的CD38和CD56（图6 b-d，分别为群组3和群组10），与未感染HIV的个体进行比较（表2）。与老年HIV感染者相比，老年虚弱者的IL-7Rα^lowCD27^lowCD28^lowEM CD8 + T细胞水平较高，没有CD38或CD56的表达（图6 b-d，第8组）。

这些发现表明，HIV和虚弱对CD8 + T细胞衰老有不同的影响。考虑到巨细胞病毒（CMV）感染与免疫衰老的可能关系，研究团队评估了感染HIV和未感染HIV的个体中细胞聚集的频率，这些个体也感染了CMV（CMV+）。与CMV+老年未感染HIV的个体相比，HIV感染个体中CD4+和CD8 + T细胞群发生改变的频率在CMV+老年HIV感染个体中仍然发生改变，这表明这些T细胞群中与HIV相关的改变似乎独立于CMV感染。

总体而言，这项多维CyTOS分析表明，接受ART治疗且未出现病毒血症的老年HIV个体表达不同分子的CD4+和CD8 + T细胞亚群发生了变化（总结见表2）。

随着岁月的流逝，免疫系统的各个组成部分，包括细胞、器官以及循环因子，均会经历显著的变化。这些变化可能使老年人面临更高的感染、恶性肿瘤以及炎症性疾病的风险。特别是在T细胞方面，随着年龄的增长，IL-7Rα^lowEM CD8 + T细胞的数量会显著增加，导致老年人体内幼稚T细胞与记忆T细胞的比例发生显著变化。

抗逆转录病毒疗法（ART）能够通过有效抑制病毒复制，可将HIV感染从致命疾病转变为可控的慢性疾病，但有报道指出，在接受ART治疗且病毒血症未被临床检测到的年轻HIV感染者中，出现了类似免疫衰老的变化，包括具有衰老特征的记忆CD8 + T细胞的扩张。多项研究通过分析与激活、衰老及细胞死亡相关的1-3个分子，探讨了HIV感染者（包括接受ART的老年人，年龄≥65岁）的CD4+和CD8 + T细胞亚群，尽管这些研究在免疫亚群的详细表型特征方面尚显不足。

在此背景下，研究通过检查外周血单核细胞（PBMCs）中的一组衰老相关基因，并运用多维CyTON分析深入剖析CD4+和CD8 + T细胞，探讨了与未感染HIV及虚弱个体相比，HIV感染是否会对老年HIV感染者的免疫衰老状态产生影响。研究的研究结果显示，在接受ART治疗且病毒血症未被检测到的老年HIV感染者中，PBMCs的年龄相关免疫改变水平有所增加，包括衰老相关基因的表达及具有衰老特征的T细胞亚群，这表明尽管病毒血症和CD4 + T细胞计数在临床上得到控制，但老年HIV感染者中可能仍存在衰老驱动因素。

研究在老年HIV感染者、未感染HIV者及虚弱个体的PBMCs中测量了一组与IL7Rα^lowEM CD8 + T细胞相关的衰老标志基因。在测量的基因中，HIV感染组中的CX3CR1、SYT11、TGFBR3、FGFBP2和NKG7相较于对照组（包括年老虚弱者）有所增加，这表明这些基因的上调可能与HIV感染相关，而与单纯的衰老或一般健康状况无关。此外，这种变化似乎并非由整体IL-7Rα^lowEM CD8 + T细胞的扩张引起，因为通过流式细胞术确定，在老年感染HIV、未感染HIV及虚弱的个体中，EM CD8 + T细胞中整体IL-7Rα^low细胞的频率相似。

然而，正如研究之前使用CyTOS和单细胞RNseq在未感染HIV的人类受试者中的发现——深入的CyTOS分析揭示了IL-7Rα^lowEM CD8 + T细胞的几个子集在HIV感染者中发生了改变，这些子集包括表达高水平趋化因子受体CX3CR1、衰老分子CD57、细胞毒性分子穿孔素和颗粒酶B以及转录因子T-bet的IL-7Rα^lowEM CD8 + T细胞亚群，这表明老年HIV感染者中表达这些分子的群体向IL-7Rα^lowEM CD8 + T细胞转变。这一发现得到了先前研究结果的支持。该研究表明，HIV感染者中CD57+和CD27-CD28-CD8 + T细胞会扩大，因为IL-7Rα^lowEM CD8 + T细胞亚群表达低水平的CD27和CD28。

值得注意的是，与未感染HIV的老年人相比，老年HIV感染者的PBMCs CX3CR1表达水平有所增加。与研究的发现一致，在HIV感染的ART受体中，表达CX3CR1的MCR7-（效应记忆标记）CD8 + T细胞的频率或百分比增加。表达高细胞毒性IL-7Rα^lowEM CD8 + T细胞的扩张可能会影响HIV感染者，尽管接受了ART，但心血管疾病的风险增加，因为这些细胞可以通过CX3CR1及其配体CX 3CL 1的相互作用迁移到血管内皮和光滑肌细胞（fractalkine），其在激活的内皮细胞上表达。

事实上，IL-7Rα^lowEM表达CX3CR1的CD8 + T细胞通过产生高水平的干扰素-γ和肿瘤坏死因子-a来上调内皮细胞上的CX 3CL 1，以及凝血酶诱导CX3CR1highEM CD8 + T细胞释放干扰素-γ。

虽然CM CD8 + T细胞的CX3CR1表达水平相对较低，但研究注意到，虽然老年感染HIV和未感染HIV的个体之间NK细胞的频率没有差异，但与未感染HIV且虚弱的老年人相比，感染HIV的老年人的这一水平似乎更高。研究意识到NK和CD4 + T细胞等其他免疫细胞，也可以表达CX3CR1。

CD38是一种跨膜糖蛋白，参与多种细胞功能，包括T细胞激活、代谢和钙动员。在HIV感染中，CD38在CD8+ T细胞上的表达上调，与疾病进展相关。然而，未经治疗的HIV感染者中，幼稚T细胞的CD38表达频率降低。在接受ART治疗的老年HIV感染者中，记忆性CD4+和CD8+ T细胞的CD38表达出现矛盾变化。具体来说，老年HIV感染者中，表达CD38的EM CD8+ T细胞亚群扩展，这些细胞高表达T-bet、Ki-67等分子，但低表达IL-7Rα、CD27和CD28。相比之下，记忆性CD4+ T细胞中，一个CXCR3水平较低的CD38high亚群在老年HIV感染者中减少。这些发现表明，HIV感染即使在病毒血症不可检测的情况下，也能推动晚分化EM CD8+ T细胞的扩展，但减少早期分化记忆CD4+ T细胞的CD38表达。

本研究聚焦于老年虚弱群体，旨在探究老年HIV感染者所呈现的免疫变化是否同样存在于伴随年龄增长而储备与功能衰退的老年虚弱者中。实证数据显示，相较于未感染HIV的老年群体，老年HIV感染者及虚弱者的CD4+与CD8+ T细胞上的CD45RA和CD28表达量显著下降，此现象与T细胞的分化及老化进程密切相关。相较之下，老年HIV感染者的CD4+ T细胞上，检查点抑制分子PD-1的表达量却有所上升，与老年未感染及虚弱个体形成鲜明对比。

老年HIV感染者的外周血中，9个衰老相关基因中有5个和7个分别呈现增加趋势。这些数据有力地佐证了，即便在接受抗逆转录病毒治疗且未出现病毒血症的老年HIV感染者中，免疫衰老现象依然显著，显示出一定程度的衰老后免疫老化。尽管具体机制尚待深入探究，但这些发现或与HIV的长期免疫刺激效应，以及其对淋巴细胞生成与稳态机制的深远影响密切相关，即便在无临床可检测病毒血症、存在巨细胞病毒等共感染或代谢状态改变的情况下。

本研究观察到，老年虚弱者的免疫细胞特征与老年HIV感染者及未感染者既有相似之处，亦存在显著差异，这进一步揭示了与虚弱相关的免疫改变具有其独特性。先前的研究已指出，老年虚弱者的外周CD28-CD8+ T细胞频率较老年非虚弱者有所降低。这一发现与研究的研究结果不谋而合，均表明老年虚弱者的CD4+与CD8+ T细胞的CD28表达减少，EM CD8+ T细胞的频率上升，同时IL-7Rα、CD27、CD8+ T细胞水平及CD28表达与老年HIV感染者及未感染者相比均呈现下降趋势。

参考文献：Shin MS, Park HJ, Salahuddin S, et al. Alterations inhigh-dimensional T-cell profile and gene signature of immune aging in HIV-infected older adults without viremia. Aging Cell. 2022;21(10):e13702. doi:10.1111/acel.13702