全澜脑科学
数十年来，非人灵长类动物因其与人类具有显著的同源性，一直被用作大脑运动皮层的研究模型。这些研究成果极大地拓展了我们对皮层控制目标导向行为的解剖学和功能结构的认知。然而，“目标”的概念以及目标导向与行为的自愿性在何种程度上重合，仍然是备受争议的问题。
皮层内微刺激相关研究表明，额叶运动系统可能已经进化为对多个身体部位的最终姿势进行编码，这些姿势类似于自然行为中的特征姿势。神经生理学研究显示，前运动神经元对特定结果的达成进行编码，例如到达特定空间位置或获取食物。通常，前运动神经元的放电与完成任务所需的伸展 - 屈曲运动序列相当独立，这与初级运动神经元不同，有时甚至与所使用的效应器无关。因此，动作目标的编码被认为是前运动皮层的基本组织原则。
以往的研究中，灵长类动物被束缚在座椅上，甚至头部也要被固定，然后被训练以高度可重复且刻板的方式执行运动任务。人们普遍假定这些发现可以解释大脑如何在不受约束的情境中控制自然行为，但实际情况未必如此。此外，在自由活动情境（FMCs）中对自发行为的神经元记录，已在小型哺乳动物中带来了重要发现，而这些发现在约束情境（RCs）下是不可能实现的。相比之下，以自由活动的猕猴为对象的行为组织研究尚未得到广泛开展，这主要是由于有线记录设备的技术限制，但无疑也是因为“自然行为的广度和复杂性令人敬畏”。
尽管对自然行为研究的关注度日益增加，并且人们认识到在约束和非约束情境下逐步比较神经编码的重要性，但对于灵长类动物丰富多样的自然行为的特定神经编码及其跨情境不变性，仍缺乏深入研究。
（A）在神经行为学记录室（NER）内的实验装置，用于在头部固定的束缚情境（RCs）和自由活动情境（FMCs）中进行神经生理学记录。（B）在Mk1的一个示例实验环节中，根据所使用的行为图谱（图S2），在束缚情境（RCs）和自由活动情境（FMCs）中的动作光栅图。（C）两只猴子在所有（n = 10）实验环节中执行的所有动作的出现频率分布（束缚情境中n = 703，自由活动情境中n = 2732）。颜色编码与（B）中相同。
我们通过慢性植入两只恒河猴中央前回的128电极阵列记录神经元活动（图1D）。在10次实验中，我们分离出424个神经元（Mk1中n = 190，Mk2中n = 234），这些神经元在整个实验过程中保持稳定记录状态，从而证明了在束缚和自由场景中记录相同细胞的可行性。根据先前的解剖功能研究，我们将能够通过25μA（或更低）、50ms脉冲串诱发运动行为，且位于前运动皮层和初级运动皮层解剖边界2mm范围内的位点才被归为初级运动皮层。我们记录的大多数记录的神经元（84.7%）位于包含F4、F5和F2区域的前运动皮层范围内，其余的可能位于初级运动皮层（图1D）。
通过比较在两种情境中记录的单个神经元的放电特征，我们发现与RCs相比，FMCs中的神经元平均放电率略有增加（图1E），峰值放电率（图1F）和放电变异性（图1G）有更明显的增加。这表明在自由活动条件下，单个神经元的活动和变异性比经典的灵长类动物座椅条件下更大。
（D）通过对Mk1和Mk2左右半球的记录区域进行变形配准得到的模板大脑中，所有记录的神经元（n = 424）的解剖位置重建和频率分布（图S3）。灰色和黑色点分别对应于在初级运动皮层和前运动皮层假定边界（虚线）尾侧（n = 65）和嘴侧（n = 359）记录的神经元（插图，彩色扇形区域）。叠加的标志点为AS（弓状沟）、CS（中央沟）和PS（主沟）。（E）束缚情境（RC）和自由活动情境（FMC）中单个神经元的平均放电率（威尔科克森符号秩检验，Z = 5.64，P = 1.7×10⁻⁸）。Spk，峰电位。（F）束缚情境（RCs）和自由活动情境（FMCs）中单个神经元的绝对放电率峰值（Z = 11.83，P = 2.6×10⁻³²）。（G）束缚情境（RCs）和自由活动情境（FMCs）中单个神经元的放电变异性（Fano因子）（Z = 10.14，P = 3.5×10⁻²⁴）。
从前运动皮层神经元活动中编码和解码自然行为
在日常情境中，即使是最简单的抓握动作，也可以针对距离不同的物体，以不同的速度、力量或轨迹执行，并且可能与不同的身体姿势相关联。没有任何两个自然行为是完全相同的。这种复杂性可以解释我们在自由活动情境中观察到的更大的放电变异性，并且可能使得研究自由活动动物中自然行为的单神经元相关性具有挑战性。此外，在RCs中研究神经元的编码特性，通常依赖于与稳定基线活动的比较，这一概念很难应用于FMCs。为了克服这些问题，我们在零假设下测试单神经元活动，即如果一个神经元对某个动作没有编码，那么其活动在动作展开过程中应保持不变。
在记录的424个神经元中，我们发现343个神经元（80.9%）在FMC中的至少一个动作中受到显著调制（P < 0.01）。在某些情况下，神经元的放电选择性地针对一个（n = 93）或两个（n = 72）动作进行调制（图2A），这表明前运动皮层神经元对自然行为存在一定程度的稀疏编码。大多数记录的细胞（n = 178）编码三个或更多不同的动作（图2B），因此表现出密集编码和混合选择性。
在自由活动情形下，多数神经元表现出密集编码和混合选择性
（A）神经元在自由活动情境（FMCs）中的一个、两个或多个（≥3）动作中表现出选择性编码。从上到下依次为攀爬、行走、抓握进食、咬、喝和打哈欠。（B）在自由活动情境（FMCs）中受调制的神经元的百分比，分为对侧（con，contralateral）和同侧（ip，ipsilateral）。（C）索伦森 - 迪塞系数（SDC）矩阵，展示了每对动作的神经元调制之间的重叠程度。树状图显示了根据沃德准则分组的动作之间的距离（d = 1 - SDC）。
这促使我们研究灵长类额叶皮层中不同自然行为的神经元表征之间的可能关系。为此，我们使用了一种变体的索伦森 - 迪塞指数（Sørensen-Dice index）来测量任意两个动作之间神经反应的相似性（图2C）。我们发现，涉及相同效应器（如嘴巴）的动作（如喝水和咬）或效应器协同控制（如前肢和嘴巴，通常在觅食行为中相关联）的动作之间，神经反应的相似性更高。相比之下，涉及更复杂全身成分的动作（如攀爬或行走）之间的分离度更大。这些结果使我们假设，与颈部和背部肌肉相关的轴 - 近端运动成分，这些成分在许多不同的动作中都会被募集，可能是前运动编码自然行为中一个重要但先前被忽视的方面。
为了验证这一假设，我们对记录到的对不同动作有调制的神经元所在的皮层位点，应用固定参数的500ms长时程ICMS刺激。通过在头部自由的条件下应用ICMS，我们能够识别出那些在头部固定条件下无法观察到或会被显著改变的轴 - 近端成分，如头部的屈曲或旋转。我们在两只猴子的四个半球中总共刺激了205个皮层位点，每个位点包含数量不等（范围为1 - 4个，每个位点平均神经元数±标准差：1.52±0.84）的在自然行为中受到调制的神经元（图2D）。ICMS引发了多种复杂的运动模式，这些模式与先前描述的一致。对打哈欠有反应的神经元更频繁地出现在ICMS诱发嘴巴运动的皮层位点（P = 1.6×10⁻⁵），而在行走动作中受到调制的神经元与手部相关位点显著相关（P = 9×10⁻⁴），对攀爬动作有调谐的神经元与控制头部轴向运动的位点相关（P < 0.05），这表明局部神经元调谐特性与ICMS结果之间存在广泛的关系。除打哈欠外，每个动作所调制的神经元中有相当一部分（26% - 40%）记录于对头部或轴向运动有贡献的皮层位点，即使仅考虑对一个或两个动作有特异性调制的细胞，这些结果在定性上仍然相似（图S6）。先前基于猕猴头部约束实验的研究支持皮层运动协同作用的存在，这些协同作用是前肢动作控制的基础。我们的发现表明，这一模型可能需要扩展，除了远端成分外，还应包括头部和轴向成分的协同控制。
（D）根据皮层内微刺激（ICMS）诱发的运动类型（颜色编码）以及在每个位点记录到的受调制神经元数量（点的大小）绘制的受刺激皮层位点的解剖分布（与图 1D 相同）。（E）从非兴奋性位点或 ICMS 触发头部 / 轴向、手部、手和嘴或嘴 / 面部运动的位点记录到的对每个测试动作有反应的所有记录神经元的比例 [颜色编码与（D）相同]。*P < 0.05；**P < 0.001。（F）Mk2 中自由活动情境（FMC）的一个示例实验环节的解码准确率（图 S7 和 S8）。（G）分类准确率作为用于训练解码器的神经活动窗口与行为事件之间的时间滞后的函数（视频 S3），每个实验环节中各动作的平均值。线条和箭头的颜色编码表示不同的记录实验环节。彩色箭头表示每个实验环节中根据肘方法分类准确率开始增加的时间点（黑色箭头表示平均值）。
尽管存在这种复杂性，我们仍能够通过将支持向量机（SVM）分类器应用于以每个动作的对齐点为中心的2秒窗口内随时间变化（500ms时间窗）的神经元反应模式，从FMCs中的单神经元活动读数中准确解码不同的自然行为（图2F和图S7）。在大多数实验环节中，将单神经元活动与多单位活动相结合，能产生更高的解码准确率，且与所使用的参数无关。通过测量在相对于目标动作的不同时间点获得的解码准确率，我们发现最高准确率出现在目标动作的对齐点及其稍后时刻，这可能对应于所有涉及身体部位与外部物体（或另一个身体部位）接触的动作中，体感和本体感觉反馈的峰值时刻。解码准确率在参考事件前1秒多就开始增加（图2G）。因此，自由活动猴子的前运动神经元活动编码了多种自然行为，并产生了可用于预测即将发生的自发行为的预期信号。
束缚情境和自由活动情境中，
单神经元和群体动力学存在很大差异
该领域当前的假设是，头部固定记录的结果应能推广到自由活动的个体。为了检验这个建设，我们重点研究了在两种情境中都执行的动作，即喝水、咬以及用对侧或同侧手抓取食物。
对于每个测试动作（图3A），我们发现，在动作执行过程中受到调制的神经元中，只有一小部分表现出跨情境不变的放电模式（图3B，示例神经元1），这一比例从喝水动作的15.9%到对侧手抓取动作的21.7%不等，且在不同测试动作之间这一比例没有显著差异（Fisher精确检验，所有两两比较中P ≥ 0.05）。在两种情境下，大多数细胞（图3A）在放电的时间模式、放电强度或两者上都表现出截然不同的活动模式（图3C，示例神经元2），这表明情境特异性特征会影响神经元反应。有人可能认为，跨情境不变的编码是前运动皮层的标志性特征，但不是初级运动皮层的特征；相比之下，我们可以直接验证，跨情境不变神经元的频率在初级运动皮层（14.3%）和前运动皮层（15.0%）中是相同的（χ² = 0.06，P = 0.8）。此外，人们可能预期跨情境不变神经元会选择性地编码特定动作或身体姿势；然而，我们发现在FMCs中，跨情境不变神经元受到调制的动作数量（5.01±2.25）显著多于情境依赖神经元（2.70±1.83；Mann - Whitney U检验，P < 0.001）。这些发现表明，神经元对动作的编码强烈依赖于情境，这表明基于约束实验结果所假设的前运动行为组织机制，实际上比之前认为的更加灵活。
（A）对于每个动作，饼图显示了在四个测试动作（咬、喝以及用同侧和对侧手抓握，自由活动情境中的抓握进食和抓取食物类别合并）期间，在束缚情境（RC）和自由活动情境（FMC）中以相似或不同方式受调制的神经元数量。（B）在四个测试动作期间，在两种情境中表现出相似调制的示例神经元。（C）在四个测试动作期间，在两种情境中表现出不同调制的示例神经元。
接下来，我们想要探究在群体水平上，RCs和FMCs中的个体行为是否以及在多大程度上保持相似的动力学。为此，我们确定了每个情境（RC和FMC）中每个动作的最优神经子空间，然后将与所有其他测试动作和情境相关的群体活动轨迹投影到这个子空间上（图S11）。接着，我们将神经群体轨迹的相似性表示为一个对齐指数，这样所有可能的两两比较结果都可以用一个相似性矩阵来表示（图3D和3E）。跨情境不变神经元在不同情境中对相同动作的编码相似，并能区分用嘴巴、对侧手和同侧手执行的动作（图3D）。相比之下，情境依赖神经元在同一情境中，对涉及相同效应器的不同动作的编码相似性（图3E中相同颜色的分支），高于对两种情境中相同动作的编码相似性。
这些发现表明，FMCs中记录的神经活动比RCs中更丰富，而不仅仅是噪声更大，并且更具普适性。这支持了在更自然的情境中研究动作规划和控制的神经元机制的相关性和价值。
总之，这些发现支持这样一种观点，即前运动皮层对动作的表征依赖于不同复杂程度的灵活运动协同作用，这在头部固定的设置中很难捕捉到，从而挑战了将RCs中的研究结果推广到FMCs的可能性。
（D）情境内和跨情境的每对动作之间的对齐指数矩阵，定义为将与一个动作相关的情境不变神经元的活动投影到另一个动作的神经子空间后的残差方差的分数。将沃德层次聚类方法应用于对称化距离矩阵（定义为1 - 对齐），以生成凝聚树状图并相应地对矩阵进行排序（20）。通过应用自举程序对神经元重采样1000次，我们发现两种情境中相同口部动作之间的对齐高于同一情境中不同口部动作之间的对齐（P = 0.037），并且对于同侧和对侧抓握动作也出现了类似趋势（P = 0.098）；涉及相同效应器（如手或嘴）的动作之间的对齐显著高于涉及不同效应器的动作之间的对齐（P < 1×10⁻¹⁵），与情境无关。（E）对于情境依赖神经元，按照（D）中的方法计算的对齐指数矩阵。同一情境中不同口部动作之间的对齐显著高于两种情境中相同口部动作之间的对齐（P < 1×10⁻¹⁵），并且对于同侧和对侧抓握动作也出现了相同的效果（P < 1×10⁻¹⁵）；涉及相同效应器的动作之间的对齐显著高于涉及不同效应器的动作之间的对齐（P < 1×10⁻¹⁵），与情境无关。对较小（n = 63）组情境依赖神经元的随机重采样始终导致相同的聚类结果（>95%），这表明（D）和（E）之间聚类结果的差异不能归因于神经元群体数量的不同。
自然行为的跨情境神经解读
（A）在各实验环节上平均的混淆矩阵，以及由四种训练 - 验证集组合产生的结果。第一行显示了使用束缚情境（RC）数据训练支持向量机（SVM）模型，然后分别用束缚情境（RC）和自由活动情境（FMC）数据进行测试时的解码性能，第二行显示了使用自由活动情境（FMC）数据训练模型，然后分别用束缚情境（RC）和自由活动情境（FMC）数据进行测试时的解码性能。（B）每个实验环节的个体解码准确率以及跨情境解码的方向性，如箭头所示（从训练数据集到测试数据集）。水平虚线对应于随机水平，显著性通过使用威尔科克森符号秩检验确定。
讨论
我们采用逐步的方法，在经典的头部约束情境（RC）和自由活动情境（FMC）中，跟踪相同神经元的活动。我们发现两种情境中神经元的放电模式和反应动力学存在显著差异，并表明FMC比RC能为自发行为提供更丰富、更复杂的神经表征。
主流观点强调额叶皮层中密集编码的重要性，认为神经元群体动力学在多种行为中是共享的。相比之下，在FMCs中，我们识别出对个体自然行为具有选择性的神经元，这表明在前运动皮层中存在一定程度的运动计划稀疏编码，这与之前在感觉区域中对输入信号的研究结果类似。显然，这一发现证实并将经典的“运动行为词汇”（vocabulary of motor acts）概念扩展到了FMCs，该概念被认为是前运动皮层以动作的直接目标为基础的表征形式。
然而，根据这一观点，对于特定动作的单神经元调制应与其目标一样在情境上保持不变，然而我们发现，在记录的神经元中只有少数在两种情境下表现出一致的调制。此外，与情境依赖型神经元相比，在自由运动条件下记录时，情境不变型神经元编码了更多种类的自发动作，这表明它们可能编码多种自发动作共有的运动协同作用，而非特定的运动目标。
与该假设相符的是，情境依赖的神经元群体在相同情境（束缚情境RC或自由活动情境FMC）中，对使用相同效应器执行的不同行为，其动力学表现出更高的相似性，而非对两种情境中相同行为的相似性。此外，对自由活动情境（FMCs）数据应用表征相似性度量表明，依赖相同效应器（如前肢或嘴巴）的自然行为与更相似的神经编码相关联，这支持了部分混合选择性可能是促进自然行为灵活组织的一种策略的观点。总之，这些发现表明，与动作目标假设相比，基于皮层运动协同作用的解释框架，能更简洁有效地揭示自发行为的前运动基础。
束缚下的皮层内微电流刺激实验得出的关于前运动皮层行为组织的另一种观点，基于最终身体姿势编码的概念。当猴子坐在灵长类动物座椅上但头部自由时，我们进行了ICMS刺激，发现广泛存在头部和轴向运动，如颈部伸展和屈曲或头部旋转，这些运动可以单独出现，也可与嘴巴、面部或前肢的其他运动相结合。这一发现表明，先前关于在前运动皮层中微电流刺激诱发躯干运动的报告，可能由于头部固定条件而存在误判，这凸显了对远端身体部位与颈部和头部相关的轴 - 近端成分进行联合控制的重要性。除打哈欠外，所有行为的神经表征都广泛地与ICMS诱发的头部和颈部运动共定位，这些运动在需要头部运动与其他效应器运动协调的多种自然行为中是共有的。基于形成“行为地图”的静态最终姿势的模型，很难解释在自发运动过程中运动和前运动神经元的变异性。因此，我们提出一个基于不同复杂程度的“运动协同词汇”（vocabulary of motor synergies）的模型，该模型涵盖初级运动皮层和前运动皮层，能够调和“运动行为词汇”和“与行为学相关的行为地图”模型，为解释目标导向行为的神经控制以及主要由皮层下机制控制的运动协同的皮层调节（如打哈欠或行走所需的机制），提供一个更灵活且有用的框架。
尽管自由活动情境中的行为种类及其执行方式，比束缚情境中丰富得多，但我们仍能够在两种情境中准确解码各种行为。在这方面，束缚情境可被视为一种过拟合模型，其中行为约束所确保的有限变异性，使得能够实现最高的解码性能，但这是以牺牲对现实世界情境的灵活性和普适性为代价的。从自由活动情境（FMCs）向束缚情境（RCs）进行跨情境解码时，性能优于相反方向的解码，这表明运动的自由度为神经编码增添了丰富性，同时并未损害其可重复性。通过揭示控制自然行为的神经策略，我们的研究结果可为开发更有效的神经调节和机器人辅助神经康复方法提供参考，以在神经系统疾病后恢复感觉 - 运动功能。
结合近期在猴子导航、决策和社会行为研究中的技术和方法进展，我们的研究为从灵长类神经生理学向灵长类神经行为学的转变铺平了道路，增进了我们对现实世界中自然行为的自主控制的理解，及其在转化研究中的潜在应用。