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J NEUROINFLAMM丨Steven团队揭示狨猴脑脊髓炎模型中TSPO的神经炎症特征


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2025年1月27日,美国国立卫生研究院Steven 团队在Journal of Neuroinflammation发表“Characteristics of TSPO expression in marmoset EAE”,揭示了狨猴实验性自身免疫性脑脊髓炎中TSPO的表达特征。
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多发性硬化症(MS)是一种中枢神经系统(CNS)的炎症性脱髓鞘疾病,也是导致年轻人非创伤性残疾的主要原因。TSPO是一种线粒体转运蛋白,在多发性硬化症患者的脑部病灶中高度表达。它被用作炎症生物标志物并被提议作为治疗靶点。然而,其在人类中的具体病理意义尚不完全清楚。普通狨猴的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是一种公认的多发性硬化症灵长类动物模型。本研究采用多重免疫荧光技术,对1只非EAE对照狨猴和8只EAE狨猴的固定中枢神经系统组织中TSPO的表达模式进行了表征。在对照中枢神经系统组织中,发现TSPO在软脑膜、室管膜以及超过三分之二的Iba1阳性小胶质细胞中表达,但在星形胶质细胞或神经元中不表达。在对照组织和急性EAE组织的Iba1阳性细胞中,发现TSPO与抗原呈递标记物(CD74)、早期激活标记物(MRP14)、吞噬作用标记物(CD163)和抗炎表型标记物(Arg1)共表达;TSPO的高表达并不局限于特定的小胶质细胞表型。在出现星形胶质细胞增生的慢性病灶中,星形胶质细胞的TSPO表达增加。最后,作者发现TSPO在一部分神经元中表达,最常见于GLS2阳性的谷氨酸能神经元。随着时间推移,TSPO的表达从Iba阳性小胶质细胞/巨噬细胞向星形胶质细胞转移,这与早期对多发性硬化症的神经病理学研究中提出的模式相似。    
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图一 在正常的中枢神经系统组织中TSPO表达于软脑膜、室管膜、血管内皮以及一部分小胶质细胞中
作者首先探究了狨猴中枢神经系统组织中表达TSPO的细胞类型,用TSPO、Iba1、CD74、MRP14、CD163、Arg1、PLP和DAPI染色,并标记了感兴趣区域(ROI)。在胼胝体白质(WM)和灰质(GM)的Iba1阳性细胞中可以观察到TSPO表达。这些Iba1阳性且TSPO阳性的细胞中有几个以更高分辨率展示。在软脑膜和大脑纵裂内的蛛网膜下腔血管的Iba1阴性细胞中,也能清晰看到TSPO染色。TSPO与软脑膜中的凝集素阳性细胞共定位,特别是蛛网膜下腔血管外部的蛛网膜,以及血管自身的内皮细胞。在对照组织的星形胶质细胞中似乎不表达TSPO。在胶质界膜的S100阳性或GFAP阳性细胞中或者在脑室相邻的灰质中,均未观察到TSPO。    
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图二 狨猴EAE模型中TSPO在Iba1阳性细胞和Iba1阴性细胞中表达
对患有实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)狨猴的脑和脊髓组织固定切片进行TSPO的常规免疫组织化学染色。对连续的系列切片进行Iba1染色以显示巨噬细胞和小胶质细胞,进行髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(PLP)染色以显示灰质和白质中的脱髓鞘情况。在急性(小于1个月)、亚急性(1-3个月)和慢性(大于3个月)的EAE病变中,与对照组织相比,Iba1阳性的小胶质细胞/巨噬细胞密度以及TSPO密度均有所增加。PLP和LFB染色显示所有EAE动物中均有脱髓鞘病变簇,而Iba-1染色显示这些病变内有密集的巨噬细胞/小胶质细胞积聚,且这些细胞对TSPO也呈强阳性。在颈髓、胸髓和腰髓中,TSPO染色在空间上与Iba1染色以及通过PLP和LFB染色检测到的脱髓鞘区域相对应。与对照组织一样,多重荧光染色显示在这些病变中TSPO与Iba1阳性细胞共定位。    
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图三 在狨猴EAE中TSPO与早期激活、抗原呈递、吞噬作用以及免疫抑制相关的标志物共定位
为了更精确地量化狨猴实验性EAE中TSPO的密度及其与细胞表型的关联,作者研究了1号动物的对照中枢神经系统组织,以及4号和5号EAE患病动物的急性EAE病灶中TSPO和免疫表型标志物的表达情况。在一片19.8毫米×16.2毫米的对照灵长类动物脑组织切片中,识别出34,345个小胶质细胞/巨噬细胞,而在每个急性病灶中大约有8000-10000个小胶质细胞/巨噬细胞。对照动物中Iba1阳性细胞的密度为每100,000像素1.13个细胞。通过对强度高于选定阈值的TSPO阳性像素进行量化,结果显示在对照CNS组织中,76.5%的Iba1阳性细胞TSPO表达高于阈值。随后,作者还对每个Iba1阳性细胞体进行扫描,检测其早期激活标志物MRP14、MHC-II分子HLA-DR 、吞噬受体CD163以及与免疫抑制相关的Arg1 的表达情况。发现TSPO与这四种标志物均存在共表达,这表明它在同时具有免疫原性和/或免疫耐受性的细胞中均有表达,并不局限于特定表型的小胶质细胞。TSPO由至少表达一种其他激活标志物(如Arg1、CD74、CD163或MRP14)的Iba1阳性细胞表达,并且在EAE中这种共表达的频率有所增加。在EAE组织中,发病小于4周的病灶内Iba1阳性细胞的密度范围为每100,000个细胞6.8-9.9个,大约是对照组织中观察到的5-10倍。在这些病灶内,超过88%的Iba1阳性细胞也表达TSPO,并且观察到CD74、MRP14和CD163的表达显著增加,但Arg1的表达未明显增加。例如,HLA伴侣蛋白CD74在对照狨猴组织中仅8.1%的Iba1阳性小胶质细胞中与TSPO共表达,而在发病小于4周的病灶中,这一比例超过50%。CD163阳性小胶质细胞/巨噬细胞的绝对数量,以及同时表达TSPO和CD163的小胶质细胞/巨噬细胞的比例,也都有明显增加。    
综上所述,首次系统地确认了TSPO在狨猴CNS中的多个部位表达,包括软脑膜、室管膜、血管内皮及部分小胶质细胞。在狨猴EAE模型中,观察到比正常组织更高比例的小胶质细胞/巨噬细胞以及部分星形胶质细胞和神经元表达TSPO。在急性病变中,小胶质细胞/巨噬细胞是TSPO的主要来源。在慢性病变中,这种贡献减少,而星形胶质细胞的TSPO表达增强,特别是在星形胶质细胞增生区域。在健康和疾病状态下,表达TSPO的小胶质细胞/巨噬细胞显示出多种免疫表型,既包括抗原呈递和急性激活标志物,也包括吞噬作用和免疫抑制标志物,说明TSPO表达并不局限于促炎症状态。这一发现揭示了TSPO在不同免疫反应中的复杂角色。   

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