1.厦门大学刘亮教授团队在《Nucleic Acids Research》期刊上发表了一项关于CRISPR-Cas系统的研究论文。
2.该研究首次揭示了靶标核酸的结合能够激活CRISPR-Cas系统效应蛋白对pre-crRNA的反式切割活性。
3.研究发现,CRISPR-Cas12a系统在体内结合靶标DNA后能够反式切割pre-crRNA间隔区。
4.基于此特性,团队开发了一种基于Cas12a的新型核酸检测平台—PDCD。
5.该平台成功实现了对猴痘病毒和SARS-CoV-2病毒的高特异性、高灵敏度的简单快速检测。
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近日,厦门大学生命科学学院刘亮教授团队在《Nucleic Acids Research》期刊上在线发表了题为“DNA target binding-induced pre-crRNA processing in type II and V CRISPR-Cas systems”的研究论文,首次揭示了靶标核酸的结合能够激活CRISPR-Cas系统效应蛋白对pre-crRNA的反式切割活性,并基于该特性开发了一种新型核酸检测方法。尤为重要的是,该研究首次证实了CRISPR-Cas12a系统在体内结合靶标DNA后能够反式切割pre-crRNA间隔区,这对基于Cas12a的基因编辑工具的开发具有深远影响。
CRISPR-Cas系统是源自细菌和古细菌的适应性免疫系统,用以抵御病毒和其他外来遗传物质的入侵。该系统的运作分为三个主要阶段:间隔区序列的获取、CRISPR RNA(crRNA)的加工成熟以及对外源核酸的干扰。其中,crRNA的成熟是CRISPR效应复合体发挥功能的必要条件,涉及到对前体crRNA(pre-crRNA)的重复区(Repeat)和间隔区(Spacer)序列的加工。此前的研究表明,在II型CRISPR-Cas系统中,crRNA的repeat区序列与另一小RNA分子tracrRNA配对后,由RNase III酶进行切割;而在V型系统中,CRISPR-Cas效应蛋白能够直接加工pre-crRNA的repeat区。然而,对于spacer区是如何被加工仍未得到阐明。
在该研究中,团队成员首先发现,在体外条件下,未加工成熟的spacer区显著降低了V型CRISPR-Cas12a系统的顺式和反式切割活性,这表明pre-crRNA中spacer区的加工成熟对Cas12a的活性至关重要。既往研究表明,Cas12a通过其WED结构域对pre-crRNA的repeat区进行加工,但在体外实验中,Cas12a对spacer区并没有表现出明显的切割作用。
鉴于靶标DNA(target DNA)可以激活Cas12a对非靶标ssDNA的反式切割,研究人员进一步探讨了这种反式切割活性是否参与了spacer区的加工成熟。实验结果显示,target DNA确实可以在体外激活Cas12a的RuvC结构域来加工pre-crRNA的spacer区域。
此外,团队成员也在其他V型CRISPR-Cas系统成员,如Cas12b、Cas12i和Cas12j,以及II型CRISPR-Cas9中观察到了这一现象。与Cas12a稍不同,Cas9仅在单链靶标DNA存在的情况下才会启动对pre-crRNA的spacer区的反式切割,且Cas9的HNH和RuvC结构域对于pre-crRNA的反式切割都是必需的。
为了验证这一加工过程在体内是否同样发生,研究人员使用大肠杆菌异源表达系统来模拟体内条件,用于观察CRISPR-Cas12a在体内结合target DNA后对pre-crRNA的反式切割情况。
通过Northern blot和small RNA测序实验,研究人员证实了CRISPR-Cas12a系统在体内存在target DNA且RuvC催化结构域完整的情况下,其pre-crRNA间隔区会被进一步加工。为了深入了解target DNA如何激活II型和V型CRISPR-Cas效应蛋白反式切割pre-crRNA过程,研究人员解析了一系列Cas12a和Cas9与target DNA及crRNA的复合物晶体结构。通过比较分析,提出了基于crRNA种子序列的初始靶标核酸识别机制,以及构象重排依赖的RuvC核酸酶结构域激活机制。
基于上述发现,团队开发了一种基于Cas12a的新型核酸检测平台—PDCD(Pre-crRNA-dependent Cleavage Detection)。这一检测方法通过将荧光基团及淬灭基团直接结合在pre-crRNA间隔区切割位点的两侧,利用Cas12a结合靶标核酸后激活的pre-crRNA反式切割活性,使得荧光基团远离淬灭基团从而释放出可检测荧光信号,实现对DNA的灵敏检测。利用该平台,团队成功实现了对猴痘病毒和SARS-CoV-2病毒的高特异性、高灵敏度的简单快速检测,展示了该技术在分子诊断领域的应用潜力。
厦门大学生命科学学院刘亮教授和陈霁云助理教授为该论文的共同通讯作者,助理教授陈霁云、2022级博士研究生林晓峰为该论文的共同第一作者,博士研究生相文文、陈莹、黄玲珑以及硕士研究生赵越明参与了该论文的研究。该研究得到了国家自然科学基金、厦门市自然科学基金和福建省自然科学基金的支持。
论文链接:
https://doi.org/10.1093/nar/gkae1241