作者:桂林市第三人民医院主任医师 程书权
近年来,国内外大量研究均已表明,HBV在肝内形成的共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)库的持续存在与HBV慢性持续性感染以及慢性乙型肝炎(CHB)难以治愈密切相关。HBV cccDNA的彻底清除不仅是判定HBV感染彻底治愈的重要指标,也是终止CHB进展为肝硬化、肝细胞癌(HCC)等诸多不良恶性事件和预后的有效评估指标。尽管核苷(酸)类似物(NAs)和长效干扰素(PEG-IFN)均能有效抑制血清中的HBV复制,并使之很快阴转,但无一能直接作用于HBV cccDNA并将其清除。
由于HBV cccDNA在肝内长期存在,导致达到功能性治愈、已发生HBsAg/抗-HBs血清转换标准的CHB用药治疗者停药后复发或HBV复阳、HBV感染相关疾病恶化的风险依然存在。HBV cccDNA完全清除后的CHB彻底治愈被国内外公认为凌驾于“功能性治愈”之上的CHB痊愈“金标准”,但知易做难,迄今问世的药物尚无一种能够达到这一目标。因此,临床转而趋向于致力开发新一代简便、大批量、易重复与动态观察的接地气的评价方法,如血清学检测,这也成为全球研究者们不断努力探索的方向。
01
目前HBV cccDNA的研究与应用瓶颈
目前,除通过有创的肝穿刺活检标本中留取标本进行HBV cccDNA的检测外,还不能完全依靠血液学的方法直接测HBV cccDNA水平。而患者对肝活检技术接受度低,迫使临床使用无创的替代指标来间接推测肝内HBV cccDNA的活动情况。虽然,传统的HBV血清学标志物例如HBV DNA、HBsAg和HBeAg等可以在一定程度上反映自然状态下肝内HBV cccDNA的活性,但经抗HBV治疗后,难以准确判断患者肝细胞核内HBV cccDNA的转录情况,且HBsAg无法区分其真正来源的HBV cccDNA和已经与肝细胞发生整合后的DNA,因此作为HBV cccDNA血清替代标志物尚有不足。
02
HBV cccDNA在病毒周期中的作用[1~5]
HBV进入肝细胞后,首先脱衣壳露出松弛环状的DNA(rcDNA),在肝细胞核内修复完整成双链并发生构象转变为超螺旋结构的HBV cccDNA,并在肝细胞核内积聚成HBV cccDNA池。然后以HBV cccDNA作为模板,转录出HBV的各种RNA,制造病毒蛋白,完成DNA复制并组装形成新的子代HBV。
03
HBVcccDNA的检测方法[1,6~10]
作为HBV复制的中介,HBV cccDNA在人体肝细胞内以微染色体的形式存在。但因在肝细胞内的水平极低,传统的分子生物学技术方法很难检测得到。目前在实验室中,公认较为准确的HBV cccDNA检测方法是Southern blot,其原理为基于核酸分子凝胶电泳迁移率的差异,能较好区分rcDNA、线性dsDNA和HBV cccDNA 等不同形式的病毒核酸,检测结果准确可靠。但仅适合肝组织标本,分析灵敏度较低,操作较为复杂,不适合高通量的药物筛选和临床应用。总体上,HBV cccDNA准确检测的核心问题是要避免其他形式的HBV DNA(尤其是rcDNA)的干扰。检测方法的选择很大程度上取决于待测样品中HBV cccDNA的含量,目前临床上最常见的检测方法为肝脏穿刺后用选择性qPCR检测HBV cccDNA拷贝数。
除Southern blot外,目前国内外已报道多种基于核酸扩增且灵敏度更高的方法。
①微滴-数字PCR(ddPCR)系统:近年武汉大学中南医院的研究人员利用ddPCR技术,开发出一种新的检测方法。优势在于能检出外周血单个核细胞和肝组织标本中的HBV cccDNA。由此更多CHB患者有望通过精确的评价方法来判断治疗效果。ddPCR通过将样本制备成数以万计的液滴,每个液滴独立进行PCR反应,以数字格式对HBV cccDNA进行定量分析。灵敏度和特异性均较为出色,大大提升了HBV cccDNA的检测下限。
②滚环扩增PCR[11]:由于HBV cccDNA在HBV DNA中所占的比例很小,因此血清中HBV DNA水平并不是敏感的病毒学指标。国内有人设计了滚环扩增(RCA)与实时PCR相结合的方法,利用Phi29DNA聚合酶设计了4组针对多个结合位点的RCA引物,由于phi29 DNA聚合酶在RCA中选择性地扩增了环状模板分子,这一步骤的加入显著提高了HBV cccDNA检测的敏感性,获得了更高效的扩增效果,并能将经典方法中忽略的整合HBV DNA的影响降到最低。
③原位杂交PCR(IS-PCR)[11]:IS-PCR为PCR和原位杂交(ISH)的结合,兼具PCR和ISH的优点,可在外周血单个细胞水平定位出单个HBV cccDNA基因拷贝。
④数字PCR:为佑安医院新建立的cccDNA检测方法,以HBV cccDNA阳性的肝组织为参照样本,比较其血单个核细胞检测的灵敏度,下限达到了最高的1 copy/μL,为临床判断CHB治疗终点提供了新的监测手段。
综上所述,现有HBV cccDNA检测方法因有创、重复性差、价格昂贵、设备稀缺、标本采集困难、不易批量进行等诸多不足,制约其在临床和高通量药物筛选中的广泛应用,尤其是血清中的直接检测。
上述可在外周血单个核细胞检测到HBV cccDNA的新技术,虽然显露出可喜苗头,但尚未得到公认,因此其实际意义仍待进一步验证,目前较难在医院普遍开展,这促使人们探索和发掘其他与HBV cccDNA高度相关的替代指标。例如近年不断被评估验证的与HBV cccDNA相关的HBV血清抗原和核酸指标,血清HBcrAg、HBV RNA与HBV cccDNA 的相关性较好,HBeAg次之,HBV DNA和HBsAg相关性相对较差等。
参考文献
1.Lee JH,Kim HS.Current laboratory tests for diagnosis of hepatitis B virus infection.Int J Clin Pract.2021;75(12):e14812.
2.Jing-Tao Huang,Ying Yang,Yi-Min Hu,et al.A Highly Sensitive and Robust Method for Hepatitis B Virus Covalently ClosedCircular DNA Detection in Single Cells and Serum.J Mol Diagn.2018;20(3):334-343.
3.XiangyingZhang,YuanTian,LingXu,etal.CRISPR/Cas13-assisted hepatitis B virus covalently closed circular DNA detection.Hepatol Int.2022;16(2):306-315.
4.Minosse C, Coen S, Visco Comandini U,et al.Simple and Reliable Method to Quantify the Hepatitis B Viral Load and Replicative Capacity in Liver Tissue and Blood Leukocytes.Hepat Mon.2023;23(10):e28751.
5.Xiaohong Shi,Xuefei Wang,Xixi Xu,et al.Impact of HBV replication in peripheral blood mononuclear cell on HBV intrauterine transmission.Front Med.2023;17(4):548-553.
6.Lucifora J,Protzer U.Attacking hepatitis B virus cccDNA--The holy grail to hepatitis B cure.J Hepatol.2016;64(1 Suppl):S41-S48.
7.Ohno M,Otsuka M,Kishikawa T,et al.Novel therapeutic approaches for hepatitis B virus covalently closed circular DNA.World J Gastroenterol.2022;28(23):7084-7088.
8.Yan Z,Zeng J,Yu Y,et al.HBVcircle:A novel tool to investigate hepatitis B virus covalently closed circular DNA.J Hepatol. 2017;66(6):1149-1157.
9.Jingwu Don,Jie Ying,Xiaoyan Qiu,et al.Advanced Strategies for Eliminating the cccDNA of HBV Dig Dis Sci.2018 Jan;63(1):7-15. doi: 10.1007/s10620-017-4842-1. Epub 2017 Nov 20.
10.Gian Paolo Caviglia,Maria Lorena Abate,Francesco Tandoi,et al.Quantitation of HBV cccDNA in anti-HBc-positive liver donors by droplet digital PCR: A new tool to detect occult infectionJ Hepatol.2018;69(2):301-307.
11.Zhong Y,Hu S, Xu C,et al.A novel method for detection of HBVcccDNA in hepatocytes using rolling circle amplification combined with in situ PCR.BMC Infect Dis.2014;14:608.