靶向高通量测序（tNGS）技术通过设计特异性引物或捕获探针，靶向检测临床标本中的病原体及其耐药基因，为感染性疾病的诊疗、监测提供证据。然而当前tNGS和宏基因组高通量测序（mNGS）临床应用场景不明确，且不同厂家tNGS技术体系差异大，结果良莠不齐，在临床适应证、实验流程、质量控制、性能验证和报告解读等方面缺乏共识和标准。
为了更好指导我国tNGS的临床实践，中国医疗保健国际交流促进会临床微生物学分会邀请微生物学、感染病学、呼吸病学、流行病学等领域的专家共同研讨和参与制订《靶向高通量测序在感染性疾病中应用与实践专家共识》。
以下简述tNGS临床适应证、技术要点、湿实验与干实验、报告发放与解读和报告模板相关的26条专家共识。
tNGS应用于感染性疾病诊断的临床适应证
目前，tNGS可用于如下3类场景：感染性疾病病原体检测、耐药基因检测、公共卫生流行病学病原监测。
病原诊断适应证
共识1：tNGS的应用场景应与mNGS有所区别和侧重。
对于非重症患者，传统微生物学检测阴性时，考虑送检tNGS；
病情危重或新发突发传染病时，考虑送检mNGS。
图1. tNGS/mNGS选择及tNGS临床解读处置流程
注：tNGS为靶向高通量测序；mNGS为宏基因组高通量测序；MDT为多学科诊疗
共识2：针对不同的感染部位，建议覆盖相应病原谱的tNGS，比如肺部感染组套、中枢神经系统感染组套等。靶向病原谱应包括该症候群难培养、罕见的病原，不宜纳入该部位无临床意义的微生物。
共识3：tNGS结果阴性而临床仍高度怀疑感染时，考虑送检mNGS。
共识4：建议根据临床需求和医疗花费选择不同tNGS方法。多重PCR扩增tNGS方法靶标少，花费较低，而探针捕获tNGS方法覆盖病原谱广，花费较高。
共识5：临床高度怀疑结核分枝杆菌感染或抗酸染色阳性需鉴别非结核分枝杆菌（NTM）感染时，考虑选用包括结核分枝杆菌复合群及致病性NTM的tNGS。
微生物耐药适应证
共识6：结核分枝杆菌培养和药敏试验时间长，建议tNGS用于呼吸道标本的结核分枝杆菌鉴定、耐药基因及其突变位点的检测。
共识7：临床怀疑特定耐药菌感染，并且耐药基因与耐药表型关联性强时，可考虑送检tNGS，作为常规方法的补充。重点关注碳青霉烯酶、超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、万古霉素耐药肠球菌（VRE）等耐药基因和病原体。
流行病学和病原监测适应证
共识8：进行新型冠状病毒、流感病毒等病毒变异监测时，可考虑选择覆盖基因组全长的tNGS。
tNGS技术要点
引物/探针设计
共识9：建议tNGS引物或探针设计遵循特异、保守、碱基均匀的原则，引物/探针及目的片段大小应控制在适当的范围，如扩增子长度宜在200 bp内，探针长度宜介于80~120 bp。引物和探针需完成干实验和湿实验的性能评价。
防污染措施
共识10：tNGS实验过程中靶标被极大富集，核酸污染风险大，建议对实验室环境、试剂、实验操作、废弃物处理等制定严格的防污染制度和预案，并定期监测实验室核酸污染。
共识11：试剂工程菌、背景环境菌、环境中的气溶胶可能导致假阳性结果。建议通过生物信息分析建立试剂和环境的基线数据库，以提高检测准确性和可靠性。
性能确认
共识12：tNGS检测中引物/探针、酶等关键原材料或检测流程中关键参数的调整可能影响检测性能。建议每次优化后的试剂和流程进行性能确认。
质 控
共识13：建议进行全流程质控，包含阴性对照、阳性对照、内参、数据量、数据质量等，且在临床报告中体现质控结果。
湿实验与干实验
核酸提取
共识14：核酸提取试剂盒应兼顾不同病原类型的提取效率，试剂工程菌不应涵盖在靶标范围内。
建库与测序
共识15：根据不同症候群、靶标范围、扩增富集效率等因素确定文库长度和最低测序数据量；测序平台的选择还应考虑测序准确性、稳定性、测序时间和成本等因素。
生物信息学分析
共识16：为确保数据质量可满足后续分析要求，建议实验室对原始测序数据进行质控和过滤，建立生物信息学数据库和分析流程，并针对此部分进行性能确认与验证。
共识17：建议实验室在国际/国内公认的公共数据库的基础上筛选高质量序列，建立本地化比对参考数据库，可包括耐药基因和毒力基因。tNGS数据库还应关注引物扩增区域以及探针捕获区域的序列特征，用于病原分型及耐药基因突变位点检测。
阳性判断值确定
共识18：实验室综合考虑标本类型、靶标类型、富集效率等因素，设立不同病原体的阳性判断值，并基于其他实验室检测结果、影像学和临床诊断等复合标准优化和确认该阳性判断值。
共识19：实验室应建立用于监测和管理生物信息学分析程序、流程及数据库的版本号，并记录版本日志，以保证报告的可复现性和可信度。
共识20：实验室应对生物信息分析的结果进行解释和验证，包括解释检出的微生物物种、基因以及突变位点的生物学和生物信息学的意义。
共识21：测序数据可考虑以fastq或bam格式双份存储于不同的储存介质，同时做好软件账户的访问权限控制。为保证数据安全，推荐部署本地服务器，并与外部网络物理隔离。
报告发放与解读
报告发放
共识22：建议对报出的微生物致病性给出初步注解，分为致病性微生物、条件致病微生物或定植微生物。
责任病原体临床判读和处置
共识23：建议结合标本类型、病原种类、均一化序列数等指标进行报告解读，在临床信息基础上判断该病原的致病等级。
阴性结果临床判读和决策
共识24：阴性结果不建议单独作为排除依据，应结合tNGS的靶标覆盖范围、标本类型和其他临床辅助检查进行综合判断。
假阴性结果常见于：
（1）设计问题导致：tNGS靶标未覆盖该微生物；
（2）湿实验技术问题导致：破壁困难导致核酸未彻底释放、微生物含量过低、标本采样不规范、存储或运输不当等；
（3）干实验问题导致：微生物序列的不完整性、比对数据库未纳入等。
耐药基因判读
共识25：建议结合相对应的病原微生物均一化序列数、耐药机制、tNGS的探针/引物设计靶标范围综合解读耐药基因检测结果。
对于结核分枝杆菌耐药检测，耐药结果显示阳性可作为耐药或异质性耐药参考依据，但耐药结果显示阴性应考虑结核分枝杆菌的载量，评判是否因检测序列数过少导致的假敏感，并参考其他分子或表型药敏结果。
对于其他细菌耐药结果，应考虑耐药机制，例如检测到耐药基因并不能直接确定该基因是否表达，无法得出药敏表型；需要区分亚型的水解酶等耐药机制，需要参考序列数和覆盖度等指标进行置信度评估。
报告模板
共识26：tNGS报告单建议标注使用的tNGS方法（探针捕获/多重PCR扩增），并可考虑分为以下主要部分：临床诊断、标本信息、病原微生物检测结果、耐药/毒力基因检测结果和病原致病性。
参考来源：感染医线
参考文献：中国医疗保健国际交流促进会临床微生物学分会. 靶向高通量测序在感染性疾病中应用与实践专家共识[J]. 中华医学杂志, 2024, 104(48): 4375-4383. DOI: 10.3760/cma.j.cn112137-20240927-02208.