HIV感染虽可治疗，却尚无根治之法。抗逆转录病毒疗法（ART）虽能有效遏制病毒复制，然需终身施治，其间药物不良反应及病毒持久性亦成隐忧。阻碍实现有效或功能性治愈之关键，在于病毒库之存在，此库一旦ART终止，即引致病毒反弹。当前，多种实验手段正探索通过激活（“震击并歼灭”）或抑制（“封锁并固守”）病毒库，以期减少反弹。然而，首要难题在于难以精准靶向体内病毒库；亦有替代方案尝试长期控制病毒反弹，如近期研究揭示，借助腺相关病毒载体递送抗HIV单克隆抗体，可在感染SHIV之灵长类动物中实现长期病毒学抑制，此乃概念验证之例证。
近期，美国乔治梅森大学传染病研究中心团队开发了一种依赖于HIV Rev蛋白的慢病毒载体，该载体仅在HIV感染的细胞中选择性表达基因。HIV Rev蛋白通过与病毒mRNA上的Rev响应元件（RRE）结合，调节病毒mRNA的核输出和翻译。利用Rev-RRE相互作用，研究实现了在HIV感染细胞中选择性表达报告基因或治疗基因。研究表明，Rev依赖性基因表达具有高选择性和严格性，不受细胞刺激影响，且该载体在体外测试中成功用于选择性表达多种治疗基因，如anthrolysin O、白喉毒素A链、TRAF6和HSV1-tk，这些基因能够选择性杀死HIV感染的细胞。
团队首次报告了使用该载体靶向SIVmac239感染的印度恒河猴中的病毒库的体内研究，结果发表于Gene Therapy期刊。
doi:10.1038/s41434-024-00467-9
研究团队基于HIV Rev依赖性载体构建了SIV Rev依赖性载体，验证了SIV Rev蛋白的功能保守性及其在诱导不完全拼接mRNA表达中的作用。通过将SIV相关序列替换HIV元件，并克隆报告基因和治疗基因（如胸苷酶基因和TRAF6基因），构建了SIV Rev依赖性载体。使用SIV辅助载体和表达载体，在HEK293T细胞中组装病毒颗粒，并通过纯化和浓缩后注射到小鼠和恒河猴体内进行安全性评估。
结果显示，注射后未观察到不良反应，且组织学分析未发现注射动物与对照动物之间的差异（图1）。
图1 针对SIV储层的SIV Rev依赖性载体的开发
a HIV Rev依赖性载体pNL-GFPRRE-SA的插图。显示了包装信号（RST）、RRE以及拼接供体（D1、D4）和受体（A5、A7）及其参与拼接的情况。在没有HIV Rev的情况下，所有转录本都被拼接，并去除GFP开放阅读框，没有GFP表达。在Rev存在的情况下，Rev与RRE结合，阻止拼接，并介导未拼接和单拼接的含GFP mRNA的核输出和翻译。表达GFP。
b 基于HIV Rev依赖性载体构建的SIV Rev依赖性载体携带报道基因或治疗基因（GFP、lacZ、SV-1-tk或TRAF6）。使用辅助载体pAD-SIV3+进行颗粒组装。
c,d 为了组装病毒颗粒，将单个SIV Rev依赖性载体与pAD-SIV3++ pLTR-SIV-Env和pCGCG-SIV-Nef共导入HEK293T细胞，并在共导入后48小时收获病毒，然后纯化并浓缩。
e,f 报告基因在用pSIV-eGFP-IRES-LacZ-RRE共感染的HEK293T细胞中的表达（e）。vSIV-eGFP-IRES-LacZ-RRE病毒颗粒被组装并用于感染SIV+细胞。观察到GFP表达（f）。
g 将颗粒静脉注射到两只恒河猴体内。注射后6个月，对其中一只猴子（BR85）进行了组织活检。显示了正常动物和注射动物之间肾脏和活体组织学的比较。肾脏肾脏结构和细胞形态看起来正常。肝脏结构和细胞形态也表现正常。
为了评估Rev依赖性载体在体内治疗SIV感染的潜在效果，研究选用了HSV-1-tk作为治疗基因。HSV-1-tk的选择基于以下两个关键因素：
①HSV-1-tk/核苷类似物介导的细胞杀伤机制已得到30多年的深入研究，并在多项临床试验中得到验证，显示出卓越的安全性和有效性。
②在无更昔洛韦（GCV）存在的情况下，HSV-1-tk不具备细胞毒性，这使得研究能够生成高滴度的慢病毒颗粒（例如，>10^10个转化单位），从而满足动物注射的需求。
相比之下，TRAF6在HEK293T细胞中表现出较低水平的细胞毒性，这导致难以产生高滴度的vSIV-TRAF6RRE颗粒，进而需要更高浓度的颗粒以达到相同效果。
印度猕猴被分为四组（A至D组）进行动物试验。A组感染SIV但未接受ART治疗；B组感染SIV并接受11个月ART治疗后停止，允许病毒反弹；C组感染SIV并接受11个月ART治疗后停止，注射vSIV-SV-1tk-RRE，不恢复ART；D组与C组类似，但在注射vSIV-SV-1tk-RRE后恢复ART 3个月。C和D组在注射前短暂耗尽CD8 T细胞，以防止载体细胞快速清除。所有组在特定时间点终止治疗并监测病毒反弹（图2a）。
实验结果总结在图2b中。正如预期的那样，A组动物在无ART的情况下病毒载量很高。在B组中，ART减少了病毒载量，病毒载量在ART终止后迅速反弹。对于C组动物，注射vSIV-SV-1-tkRRE/GCV未能抑制ART终止后的病毒反弹，表明注射的载体量无法与不受控制的SIV复制竞争。然而，对于D组的动物，给予vSIV-SV-1-tk-RRE/GCV抑制了ART终止后的病毒反弹（图2b）。两只动物之一KC50的病毒载量通过vSIV-SV-1-tk-RRE/GCV处理降低至基线水平。
图2 在SIVmac239感染的印度恒河猴中对SIV Rev依赖性载体进行体内测试
a 研究A-D组不同治疗和载体注射设计的示意图（各组n = 2）。
b A-D组动物SIVmac239感染、ART、vSIV-SV-1-tk-RRE/GCV注射和vSIV-TRAF6（R）-RRE注射后的血浆病毒载量（拷贝数/ml）。
在D组治疗方案的重复实验中，SV-1 tk/GCV注射有效控制了病毒反弹，但无法完全降低至基线水平，可能是由于部分靶向库细胞的限制。为进一步提升效果，尝试使用vSIV-TRAF6-RRE载体，但导致两只动物严重不良反应并死亡。随后，使用vSIV-TRAF6（R）-RRE载体进行测试，成功减少了病毒反弹，并通过两次注射使病毒载量降至无法检测水平，动物KC50能够自我控制病毒反弹，长期维持低病毒载量。
为了证实定量外周血病毒血症获得的结果，研究还定量了脑脊髓液（CSF）中的病毒载量（图3）。D组的CSF样本大约每20周采集一次。在注射任何SIV Rev依赖性颗粒之前，KC50和JT43的CSF中均存在可检测水平的SIV。给予每种SIV Rev依赖性载体治疗后，JT43均表现出CSF病毒载量下降。第一次载体注射后，KC50保持未检测到的CSF病毒载量，表明病毒血症控制扩展到了CSF。
图3 CSF病毒载量和外周CD4 T细胞库的定量
a 用Rev依赖性载体处理的动物中CSF病毒载量的定量（D组）。
b 来自KC50的外周血CD4 T细胞的定量病毒生长试验（QVOA）。在第159周从KC50中收集单核细胞，纯化CD4 T细胞，并用CFA加IL-2激活。将细胞连续稀释（5倍稀释），与CEMx174细胞（1 x 105）混合并共培养两周。收集培养物上清并使用qRT-PCR通过SIV RNA进行定量。qRT-PCR检测限为83拷贝/ml。计算了IUMP（每百万感染单位）。
用定量病毒生长试验（QVOA）进一步定量了KC50外周血中的CD4 T细胞库。在第159周从KC50中收集外周血单核细胞（BMC），纯化CD4 T细胞，连续稀释（5倍，从100万个细胞开始），激活，然后与CEMx174细胞共培养两周进行病毒扩展。使用qRT-PCR对培养上清的细胞相关（CA）SIV RNA进行定量。如图3b所示，研究在所有稀释液中均未检测到CA SIV RNA，这表明外周血CD4 T细胞中病毒库的减少。但病毒库很可能仍然存在——KC50在血浆中出现了两次病毒载量峰值（图2b）。
研究显示，使用Rev依赖性载体注射SIV Rev依赖性载体可以有效诱导中和抗体（nAb）的产生，尤其是在注射vSIVSV-1-tk-RRE后，观察到对1级假病毒SIVmac251.6的高水平中和作用，并在第55-60周开始对2级假病毒SIVmac239CS.23产生中和作用。此外，注射vSIVTRAF6（R）-RRE后，中和抗体水平逐渐升高，第二次注射后48周内滴度增加至4倍。这些高活性中和抗体的产生与血浆病毒血症的控制相关，表明靶向病毒库细胞的策略可能有助于控制病毒血症（图4）。
图4 KC50中中和抗体的定量
使用基于假病毒的抗体中和试验进行中和抗体的定量，该试验利用携带1级毒株SIVmac251.6包被的假病毒或MLV假型病毒作为阴性对照（a）。还对携带2级毒株SIVmac239CS.23包被的假病毒进行了定量（b）。ID50值代表发生50%中和时的血清稀释度。为了进行比较，还绘制了KC50中的血浆病毒载量（红线）。针对MLV假病毒的背景信号均<20。中和抗体活性呈阳性是基于MLV对照品≥3x信号的标准。
本研究首次在动物模型中验证了Rev依赖性载体减少HIV/SIV病毒库的能力，观察到该载体在体内减少病毒反弹的效果。接受治疗的动物KC50在ART终止后两年内大部分时间血浆病毒血症保持在检测不到的水平，且中枢神经系统病毒血症也缓解至检测不到的水平。尽管KC50感染了最具致病性的SIV SIVmac239，且缺乏关键的免疫基因表达，但多次注射Rev依赖性颗粒后仍能控制病毒血症。研究推测，Rev依赖性载体通过初始放大和动员，结合GCV介导的细胞杀伤，可能减少了病毒库，从而诱导出更高效的二级中和抗体，有助于控制病毒血症。此外，Rev依赖性载体可能增加中和抗体的广度，有助于在患者中诱导出更广泛的nAbs。
记忆T细胞与巨噬细胞中Rev依赖性载体的感染与动员，或可使载体抵达通常难以触及的保护性区域，如淋巴组织及中枢神经系统。GCV已证实能穿越血脑屏障（BBB），此举或可令CNs特异性瞄准SIV感染之细胞。值得关注的是，在大鼠体内进行HSVtk载体囊内注射并辅以全身性GCV给药后，大脑肿瘤细胞的靶向杀伤现象得以显现。
研究未对受Rev依赖性颗粒刺激的抗SIV CD8 T细胞进行量化，但研究推测，CD8 T细胞在抑制病毒库及反弹过程中扮演重要角色。在本研究中，CD8 T细胞于颗粒注射期间短暂耗竭，此或导致储库重新激活，从而为库细胞中载体更大程度的放大与动员提供了可能。
血液静息记忆CD4 T细胞是HIV的主要储存库，而终末分化的HIV+巨噬细胞可抵抗病毒介导的细胞死亡，并充当持久的病毒生产细胞。HIV+血液CD4 T细胞和巨噬细胞已被证明在体外被Rev依赖性载体靶向和选择性杀死。GCV还被证明能够靶向有丝分裂后细胞，并在兔炎症性关节炎模型中注射HSV-tk后诱导终末分化的滑液内膜细胞的杀伤。研究发现，中枢神经系统中病毒反弹的抑制可能是由巨噬细胞携带进入大脑的Rev依赖性载体介导的。
研究显示，注射Rev依赖性颗粒和诱导高滴度2级nAb后，病毒血症显著下降。图4a表明，1级nAB在首次注射后增加，但后续注射未立即诱导1级nAB。1级nAB的第二个峰值与2级nAB的诱导时间重叠，可能反映了2级nAB的诱导。研究认为，诱导广泛nAb与感染持续时间相关，而与病毒特性无关。Rev依赖性颗粒可能通过过度感染库细胞并持续释放缺陷病毒，刺激抗病毒免疫和nAb的产生。这提出了一种“康复和救赎”策略，即使用Rev依赖性载体转化库细胞以释放非感染性颗粒，刺激nAb产生，从而实现病毒血症的长期控制。
局限性：
1. 仅在少数动物中进行了单次或两次注射，未来需更多动物多次注射以研究病毒血症控制机制和Rev依赖性载体的功效。
2. 未量化细胞介导的免疫反应（RCM），未来需评估其作用。
3. 仅量化了针对两种病毒株的nAB，未来需使用多种病毒株量化广谱nAB（bnAB）。
4. 未充分研究vSIV-TRAF6-RRE载体引起的严重不良反应，可能与颗粒中高水平的TRAF6或其他人类蛋白有关，需进一步研究。
人类免疫缺陷病毒（HIV）的持续存在阻碍了其根除，因此HIV感染者需要终身接受抗逆转录病毒治疗（ART）。目前，尚无有效疗法能够在停止ART后防止HIV反弹。在此，研究介绍了一种HIV/SIV Rev依赖性慢病毒颗粒，该颗粒可通过给药抑制病毒反弹。利用猴免疫缺陷病毒（SIV）感染的恒河猴模型，研究证实，将预组装的SIV Rev依赖性慢病毒颗粒施用于感染SIVmac239的印度恒河猴，可显著减少ART终止后的病毒反弹。其中，接受注射的动物KC50在ART终止后的两年多时间内，其血浆和中枢神经系统中的病毒血症大部分时间均维持在检测不到的水平。
分子和免疫学分析显示，Rev依赖性载体的施用与中和抗体（nAbs）的诱导同时发生，表明nAbs在控制病毒血症中起关键作用。此研究不仅强调了nAbs在病毒血症控制中的重要性，还提供了Rev依赖性载体可用于体内靶向病毒库（包括中枢神经系统库）的概念验证。未来仍有必要进行大规模体内研究以深入探讨Rev依赖性载体诱导的病毒血症控制机制。