【前沿&进展】PLoS Pathog | 夏宇尘研究组揭示乙肝病毒cccDNA形成新机制
近日，病毒学国家重点实验室/武汉大学泰康医学院（基础医学院）医学病毒学研究所/武汉大学泰康生命医学中心夏宇尘教授研究组在国际学术期刊PLOS Pathogens上在线发表题为Hepatitis B virus hijacks MRE11-RAD50-NBS1 complex to form its minichromosome的研究论文。该研究利用体外合成病毒基因组、蛋白组学筛选、感染模型功能验证及DNA体外修复体系等手段筛选并揭示了MRN复合体（包含MRE11、RAD50和NBS1三种组分）在乙肝病毒微染色体cccDNA形成中的重要作用。
全球约有2.57亿慢性乙肝感染者，其中大约三分之一在中国。乙肝病毒感染者发生肝硬化和肝癌的几率高，我国每年约有30-40万人死于乙肝病毒导致的肝硬化及肝癌。虽然目前有针对乙肝病毒的疫苗和药物，但慢性乙型肝炎仍很难被完全治愈。乙肝病毒感染肝脏后，会形成病毒自己的微染色体cccDNA。cccDNA作为病毒复制的模板在被感染的细胞中长期稳定存在，现有药物无法将其彻底清除。全面深入地解析cccDNA的形成及调控机制不仅可以加深对乙肝病毒宿主互作机制的了解，而且有助于发现新的抗病毒靶点、为开发新的治疗药物提供理论基础。早期在体外系统中的研究表明，五种纯化的人类蛋白质/复合物（增殖细胞核抗原（PCNA），复制因子C（RFC）复合物，POLδ，FEN-1和LIG1）即可完成由乙肝病毒rcDNA到cccDNA的合成（Wei et al. Nat Microbiol, 2020）。然而在复杂的胞内/核内环境中，受到蛋白表达量、亚细胞定位、与rcDNA可接触性、蛋白功能冗余性等因素的影响，是否还存在cccDNA形成过程中的其他关键因子并不清楚。为全面解析参与rcDNA修复形成cccDNA的宿主因子，研究人员首先体外制备了生物素标记的rcDNA分子，之后利用rcDNA体外修复系统富集了与其结合的宿主蛋白。通过质谱分析共鉴定了28种与DNA损伤修复相关的蛋白，其中包含了已报道的参与rcDNA修复的DDB1、PCNA及RFC等蛋白。有趣的是，这28种蛋白中包含了MRN复合体的三种组分：MRE11、RAD50及NBS1。Western blotting及ChIP实验进一步验证了MRN复合体与HBV DNA之间的相互作用，提示MRN复合体可能在cccDNA形成中起着重要作用。敲降MRN复合体显著下调包括cccDNA在内的各个指标，而回补表达MRN复合体可以恢复这些指标。但在已建立HBV cccDNA的细胞中敲降MRN复合体并不会影响cccDNA水平及其他病毒指标，表明MRN复合体并不会影响cccDNA的转录活性及稳定性。进一步对cccDNA形成的时间动态分析发现，敲降MRN复合体可以在病毒感染的早期减少cccDNA的水平，表明MRN复合体参与了cccDNA的形成调控。MRN复合体中的MRE11组分具有核酸内切酶活性和3’-5’核酸外切酶活性。用小分子抑制剂PFM01和Mirin分别抑制MRE11的核酸内切酶和外切酶活性可显著降低cccDNA水平，表明MRN复合体的核酸酶活性在cccDNA形成过程中发挥着重要作用。此外，体外证实了纯化的MRE11蛋白可以切割rcDNA分子，表明MRN复合体可以以rcDNA为底物直接进行切割，并以此参与rcDNA的修复。进一步研究发现MRN复合体可以通过其酶活性协同ATR-CHK1通路参与调控cccDNA形成。值得注意的是，剔除了MRN复合体的细胞裂解液在体外仍能修复rcDNA形成cccDNA，提示体外修复模型并不能完全反映病毒真实感染的状况。
综上所述，该研究揭示了参与rcDNA修复形成cccDNA过程中的宿主蛋白，并阐述了MRN复合体通过其酶活协同ATR-CHK1通路调控cccDNA形成的分子机制，为靶向cccDNA的药物研发提供了新的思路。
武汉大学泰康医学院（基础医学院）博士后赵凯涛和博士研究生王晶晶为该论文的共同第一作者，夏宇尘教授和程晓明研究员为通讯作者。该研究工作得到了国家重点研发项目（2023YFC2308404）、国家自然科学基金（81971936、32100125）、平原实验室开放课题重点项目（2023PY-OP-0101）等项目资助。