编者按：CRISPR/Cas系统是一种强大的基因编辑工具，其在临床中的应用已经展现出广泛的可能性和潜力，尤其是在基因治疗和疾病诊断等方面。本期“结核之窗”栏目中，卢水华教授团队将分享一项发表于《应用化学》（Angewandte Chemie International Edition）的研究。该研究设计了一种CRISPR-CS系统，通过协同剪切机制提高了核酸检测的灵敏度和速度，实现了对低至9.5×10-20 M靶标的快速检测，为临床诊断提供了一种潜在新工具。

研究简介

研究背景

CRISPR/Cas系统作为一种功能强大的基因编辑工具，在分子诊断、治疗和生物传感等领域应用广泛。其中，Cas12a可通过靶标的原间隔序列临近基序（PAM）序列以及靶标和CRISPR RNA（crRNA）的特异性互补识别和切割靶标，同时激活Cas12a切割单链DNA的反式切割活性。因此，将Cas12a的反式切割活性与等温扩增方法相结合被广泛用于疾病诊断以及生物传感领域。

然而，目前CRISPR/Cas系统在传感领域面临着一个亟待解决的问题是CRISPR/Cas系统剪切效率，而这与其信号输出密切相关。在常规的CRISPR/Cas检测系统中，由于靶标核酸分子多阴离子性质，其结构受到静电力的强烈影响。此外，核酸的折叠问题与单体单元的数量有关。单体结构单元之间的强相互作用使得形成特定序列的特定结构变得困难。因此，具有许多碱基对的目标序列倾向于堆叠并覆盖显著程度的结合位点。在传统CRISPR/Cas系统中，可用的结合位点数量有限，相应的剪切能力也有限。因此，基于CRISPR/Cas系统的当前电化学传感平台的检测限通常难以达到fM（10-15 mol/L）水平，并且需要长时间的孵化以及预处理，这使得进一步提高检测性能变得困难。因此，迫切需要一个系统，能够克服现有CRISPR/Cas系统在剪切效率方面的限制。

研究内容

1. 设计协同剪切CRISPR/Cas系统（CRISPR-CS系统）

在本研究中，作者利用两个不同的Cas12a-crRNA复合物分别与靶标DNA上的两段不同靶标序列结合，形成独立的三核螺旋复合物，从而激活Cas12a酶的切割活性。在部分折叠的靶标序列中，一旦靶向位点被覆盖，传统CRISPR系统中的Cas12a-crRNA复合物将无法与靶标结合，而CRISPR-CS系统因其在不同位点协调使用两种Cas12a-crRNA复合物，使得该系统仍然具有很高的识别效率，显著地提高了与靶标的结合和捕获效率，增强了协同剪切效应。在工作电极表面覆盖一层石墨烯薄膜，石墨烯薄膜上含有亚甲基蓝（MB）的四面体DNA纳米结构（TDN-MB），当施加负电位时，由于DNA骨架的负电荷，使得TDN-MB在溶液中保持直立，并且悬臂末端的MB远离Au电极,此时的高电信号视为初始信号。靶标的引入促使两个Cas12a-crRNA复合物与靶标DNA上的两个位点结合，从而激活Cas蛋白的反式切割活性，导致TDN-MB上的单链悬臂被切断，将MB分子推离电极，从而使原本的高电信号显著降低。因此，可以通过监测电信号的变化来准确地检测靶标的存在。

图1. CRISPR-CS的工作原理

2. CRISPR/Cas系统可行性验证与优化

为了验证该方法的可行性，作者以猴痘病毒（Mpox）为例，针对B6R以及F3L区域设计两种crRNA，随着Mpox核酸浓度的增加10−19  M至10-15  M，DPV响应的峰值电流逐渐降低（图2a）。表明CRISPR-CS的协同裂解活性随着靶标浓度的增加逐渐增强，导致更多的MB从悬臂上释放，进而使得电位降低。为了验证CRISPR-CS系统的优越性能，作者准备了两个额外的检测系统。这两个体系不同于CRISPR-CS同时靶向F3L和B6R基因，它们分别同时靶向F3L基因（Double-F3L）和B6R基因（Double-B6R）。当Mpox核酸添加浓度超过10−14 M时，CRISPR-CS、Double-F3L、Double-B6R的电位变化均趋于稳定（图2b）。其中，CRISPR-CS检测范围更广，信号变化明显。CRISPR-CS的KD值比其余两种系统低一个数量级，证明CRISPR-CS具有更强的结合亲和力。随后，作者测试了三种检测系统在检测10-17 M浓度的Mpox靶标时不同时间的电位变化，CRISPR-CS在5分钟时电位变化即可达到稳定状态，而Double-F3L和Double-B6R则需要12分钟（图2c）。CRISPR-CS可以区分来自其他病毒核酸（如牛痘、天花和牛痘）的Mpox核酸，在Mpox核酸检测中具有很高的特异性（图2d）。因此，CRISPR-CS系统的协同剪切效应不仅提高了检测灵敏度，而且加快了反应速度。与其他方法（光电（PEC）、电致发光（ECL）、荧光、电化学（EC）和基于CRISPR的EC）相比CRISPR-CS系统在检测时间和LoD方面表现优异（图2e和表1）。为了评估CRISPR-CS的可重复性，作者通过CRISPR-CS分别在10−19  M、10−18  M和10−17  M浓度下对Mpox核酸进行了10次连续重复测量（图2f），实验结果表现出很好的稳定性。

图2. CRISPR-CS系统的设计比较与优化

表1. 已报道的CRISPR电化学核酸检测方法与本研究的微电极的性能比较

3. CRISPR/Cas系统性能测试

CRISPR-CS的生物检测包括生物识别和信号转导两个过程。在生物识别中，剪切活性当目标核酸的两个分析物序列与两种类型的Cas12a-crRNA双链结合时，Cas12a被激活。这一过程不仅触发了剪切反应，还通过协同效应显著提高了Cas12a在TDN悬臂上的剪切效率，促进更多MB分子从电极表面释放出来。为了进一步证实这一效果，作者用荧光代替了TDN悬臂上的MB。在加上当Mpox核酸浓度为10−16  M时，CRISPR-CS系统在大约4分钟内诱导了明显的荧光猝灭，而在Double-F3L和DoubleB6R系统中，则需要大约10分钟，从而证实了CRISPR-CS系统的切割效率（图3a）。探针的结构对于CRISPR-CS系统的信号输出也是非常重要的。作者制备了5种不同结构的TDN-MB报告基因，包括17 bp-10、17 bp-20、17 bp-30、17 bp-20和37 bp-20。当添加10−16 M Mpox核酸时，具有17 bp-20结构的TDN-MB产生显著的ΔI/I0响应，其响应至少是其他四种结构的1.3倍（图3b）。这些发现表明，适当大小的碱基和悬臂对于CRISPR-CS系统中的生物检测至关重要。此外，电化学的结构设计显著影响CRISPR-CS的传感性能。石墨烯的引入显著增强了电化学检测的初始信号。因此，CRISPR-CS系统在检测相同浓度的Mpox核酸时能够产生更强的ΔI/I0响应（图3c）。为了验证CRISPR-CS系统的多功能性，作者设计了新的crRNA探针（图S13），并将其应用于检测人乳头瘤病毒（HPV）核酸和肌萎缩侧索硬化症（ALS）。核酸浓度为10−13 M的HPV核酸或浓度为10−12  M的ALS核酸，CRISPR-CS的ΔI/I0应答为分别为0.52和0.77。

图3. CRISPR/Cas系统性能测试

4. 临床样本验证

聚合酶链反应（PCR）需要在提取DNA后进行核酸扩增和纯化，而CRISPR-CS可以在通过试剂盒提取基因组后直接进行，可以大大缩短检测步骤和时间（图4a）。作者检测了36份HPV临床样本，其中16份阳性，20份阴性。同时，作者对其中一份样本进行梯度稀释测试，随着临床样本浓度的增加，电化学检测信号逐渐降低,表明CRISPR-CS可以检测不同靶标浓度的临床样本（图4b）。阳性样品的归一化电流（0.17～0.69）显著大于阴性样品（0.02～0.21）（P<0.001）。为了建立一个更有效且通用的疾病诊断平台，作者选择SVM作为机器学习算法，将36份临床样本测试的108个数据点划分进训练集和测试集。在训练集中包含76个数据点，包括42个阴性、31个阳性，在训练集中，该模型在HPV临床样本检测中表现良好，有3个样本被误诊为阴性，准确率为94.52%。另外使用35个数据点（20个阴性数据点和15个阳性数据点）对模型进行验证，其中只有1例被误诊，准确率为97.14%，相对于训练集的准确率进一步提高。结果表明，CRISPR-CS模型表现出优异的性能，能够有效区分阴性和阳性样本（图4e）。该平台实现了目前最灵敏的核酸电化学检测，直接检测未扩增的临床样品，与临床PCR结果高度吻合。

图4. 利用CRISPR-CS系统进行临床样本检测

研究总结

1. 本研究通过结合2组CRISPR/crRNA建立了CRISPR-CS系统用于核酸检测，克服了目标序列折叠导致的剪切效率低下的问题，实现5分钟内检测低至9.5×10-20 M的靶标

2. CRISPR-CS系统是迄今为止最灵敏的非扩增电化学核酸检测，能够直接在未扩增的临床样本中进行测试，准确率为98.1%

3. CRISPR-CS系统适用于多种样本类型核酸检测，比如Mpox、HPV以及肌萎缩侧索硬化症（ALS）

专家点评

研究亮点

作者设计的CRISPR-CS系统，克服了由靶标序列折叠引起的剪切效率下降的问题，该平台实现了目前最灵敏的核酸电化学检测，可在较短时间内直接检测未扩增的临床样品，有力地推动了该技术在临床诊断领域的进一步发展。

研究局限

1) 作者并未对CRISPR-CS系统在检测有无折叠区域存在的靶标核酸进行平行比较，无法证明CRISPR-CS系统的更优性能是否是仅仅因为多组crRNA协同作用加快了反应效率，比如即使靶标核酸不存在折叠结构，多组crRNA协同相比于常规单个crRNA的检测效果也会更好。

2) 临床样本数量有限，尤其是在机器学习验证时应当使用不同的样本队列，得到的结果会更加准确。

▌参考文献：

Zhao J, Kong D, Zhang G, et al. An Efficient CRISPR/Cas Cooperative Shearing Platform for Clinical Diagnostics Applications. Angew Chem Int Ed Engl. 2024;63(52):e202411705. doi:10.1002/anie.202411705

卢水华 教授

教授，主任医师，二级教授，博士生导师

国家感染性疾病临床医学研究中心副主任，深圳市第三人民医院肺病医学部主任

担任：中华医学会结核病分会候任主委，世界卫生组织全球儿童和青少年结核病工作组成员，中国防痨协会学校与儿童结核病分会主委，上海市医学会结核病学分会荣誉主委，广东省医学会结核病学分会主委，第二届国家名医获得者，上海市十佳医师，国家十三五传染病重大专项负责人，国家自然基金重大课题负责人，国家卫健委流感医疗救治专家组成员，国家自然科学基金评审专家，国家药监局新药评审专家，国家药监局医疗器械评审专家，中华医学会医疗鉴定专家，多杂志副主编、编委及审稿专家

长期致力于TB的发病机制、疫苗与诊断技术开发、流行病学及新药临床试验等领域的研究：深入开展大规模人群队列研究，明确我国大学生人群Mtb感染率和BCG保护效率；构建和组织实施“结核感染免疫诊断分层解决方案”，牵头完成我国40年来首个结核I类新药（EC）的临床试验及上市；积极探索TB防控“关口前移”新策略，建立和推广结核潜伏感染早期筛查和精准干预体系；针对当前TB防治瓶颈问题，提出的“一体化综合防控策略”为“End TB”贡献了中国原创理论和技术产品体系。主持包括国家“十三五”传染病重大专项、重大新药创制项目、国家自然基金重大课题在内的国家、省部和市级科研项目11项，合计研究经费超7260万元。在NEJM、Lancet、PNAS等顶级期刊发表学术论文73篇，组织撰写指南与专家共识3篇，主编专著1部。相关成果获“中国防痨协会科学技术奖”一等奖和“上海医学科技奖”三等奖，多次被WHO指南引用

东亚娟

复旦大学病原生物学2023级博士研究生

主要研究方向：基于CRISPR技术分子诊断法的开发与应用。累计发表学术论文4篇，其中一作3篇。参与多项国家级自然科学基金项目。