好书推荐！《动物行为实验指南》电子版pdf，网盘发货

《动物行为实验指南》共674页，涵盖了常见的实验动物，如小鼠、大鼠和斑马鱼，详细描述了每一种行为测试的实验设计、测试设备、实验流程、评估指标、预期结果、常见问题及解决方法、数据分析、模型应用与局限性等各个方面。它通过快速引导，帮助研究人员高效地掌握实验的每个阶段，减少了查阅文献和寻找方法的时间，成为各类科研人员的重要参考资料。

《动物行为实验指南》共计收录了16种动物行为类型，包括焦虑抑郁、学习记忆、痛觉、运动、恐惧、社交、癫痫、操作、成瘾、视觉、痒觉、味觉、嗅觉、睡眠、斑马鱼行为以及常见动物模型等内容。每一类动物行为下，都详细介绍了多个经典的实验范式，涵盖了超过100种实验方法。

睡眠是动物的一个重要生理过程，受昼夜节律和体内平衡过程的调节。在苍蝇、小鼠、狗和人类中采用的遗传学方法已证明在发现调节睡眠的基因方面很有效。实例包括食欲素/下丘脑泌素及其受体在维持清醒方面的发现，和盐诱导激酶3（SIK 3）在调节睡眠方面的发现。

2024年12月30日，北京大学生命科学学院神经化学生物学实验室饶毅团队在Cell Chemical Biology杂志上发表题为《Calcineurin: An essential regulator of sleep revealed by biochemical, chemical biological, and genetic approaches》的论文，该研究发现，通过生物化学纯化和光交联技术的组合，作者将钙调神经磷酸酶鉴定为SIK 3在其T469和S551位点（但不是T221）的上游磷酸酶。最终发现钙调神经磷酸酶-SIK 3信号通路可以调节哺乳动物的睡眠。            

• T469在调节小鼠睡眠中的功能意义  

作者构建了T469 A置换的小鼠系。结果发现，在24小时内，与Sik 3 +/+相比，Sik 3 T469 A/+雄性的总睡眠和NREMS持续时间增加，尤其是在黑暗阶段。NREMS发作次数和发作持续时间均未显示显著变化。EEG的功率谱delta增加，alpha减少。通过NREMS delta功率密度测量的睡眠需求在Sik 3 T469 A/+雄性中显著增加。    

• SIK 3的T469和S551磷酸酶的生化纯化  

作者从HEK 293 T细胞中纯化了能够在T469和S551处使SIK 3去磷酸化的磷酸酶。作者裂解HEK 293 T细胞并在Q HP、Blue HP、SP HP、肝素HP、羟基磷灰石（HAP）HP和Superdex 200柱上依次分级分离500 mg细胞裂解物（浓度为10 mg/mL）。在纯化过程中，作者观察到T469的PPase活性与S551的PPase活性高度相关，并且在每个纯化步骤后总体PPase活性增加。最终检测到四种PP酶：PPP 3CA、PPP 3CB、PPP 3CC和PPP 5C。   

• 在小鼠脑中发现PPP 3CA作为SIK 3的蛋白质-蛋白质相互作用伴侣 

为了研究小鼠大脑中的体内相互作用，作者发明了一种光交联方法来寻找体内与SIK 3相互作用的蛋白质。仅发现一个催化PPase亚基-PPP 3CA，连同其相应的调节亚基PPP 3R 1。为了证实SIK 3和PPP 3CA在脑中的相互作用，作者在免疫沉淀实验中使用了SIK 3的抗体，并在沉淀物中发现了SIK 3和PPP 3CA。类似地，当使用抗PPP 3CA抗体沉淀脑裂解物时，在沉淀物中发现PPP 3CA和SIK 3。当将FLAG标记的SIK 3和HA标记的PPP 3CA引入HEK 293 T细胞中时，这可以在HEK 293 T细胞中重现。这些结果提示，在小鼠脑中PPP 3CA作为SIK 3的蛋白质-蛋白质相互作用伴侣。    

• PPP3CA对T469和S551的体外去磷酸化，但对T221无影响  

在PPP3R1存在下，通过PPP3CA、PPP3CB和PPP3CC将SIK3的T469和S551去磷酸化。相反，PPP3CA、PPP3CB和PPP3CC不能使T221去磷酸化。在存在PPP 3R 1的情况下，从HEK 293 T细胞免疫沉淀的PPP 3CA使MEK 1的S217脱磷酸化，但不使AKT 1的T308、PDK 1的S241等脱磷酸化。为了排除从HEK293T细胞免疫沉淀的酶含有与PPase相关的蛋白质的可能性，作者在E.杆菌作者发现CaM、PPP3CA、PPP3R1和Ca2+都是SIK3体外T469和S551去磷酸化所必需的。    

• 小鼠大脑中T469和S551（而不是T221）的体内去磷酸化需要PPP 3 CA和PPP 3 R1  

为了研究它们在体内的作用，作者使用CRISPR-Cas9策略靶向小鼠脑中的PPP 3CA或PPP 3R 1。Western分析显示，靶向PPP 3CA或PPP 3R 1的sgRNA降低了它们的蛋白水平。当PPP 3CA被靶向时，PPP 3R 1也被减少。在PPP 3R 1 KD小鼠中，PPP 3R 1、PPP 3CA和PPP 3CB减少。在脑中敲低PPP 3CA或PPP 3R 1后，SIK 3中T469和S551而不是T221的磷酸化水平增加。

• PPP 3CA和PPP3R1对睡眠的体内生理需求   

为了研究内源性PPP 3CA在小鼠中的生理作用，作者分析了PPP 3CA KD小鼠的睡眠表型，并将其与对照小鼠（WTCtrl和eGFPCs）的睡眠表型进行比较。在EEG或EMG的一般模式方面，三种基因型之间没有显著差异。PPP 3CAKD小鼠中24小时内的总睡眠与eGFPCa或WTCtrl对照小鼠相比减少约3小时。PPP 3CAKD小鼠的NREMS显著降低。但NREMS发作持续时间缩短。在暗相期间，NREMS发作的次数而非持续时间减少。脑电功率谱分析显示，只有在ZT 15和ZT 23时NREMS δ功率密度降低，而在其他时间没有降低。在REMS和NREMS之间，转换的概率增加。SD 6 h后，WTCtrl和eGFPCs小鼠的NREMS或总睡眠/觉醒逐渐恢复，而PPP 3CAKD小鼠SD后的恢复显著降低。

对全脑的Western分析显示，PPP 3 R1 KD小鼠的PPP 3 R1蛋白表达水平显着降低。在PPP 3R 1 KD小鼠中，除了从亮到暗过渡的5 ZT h之外，在亮相和暗相的每个ZT处的睡眠持续时间显著减少，在24 h内减少至少5 h。在整个24小时内，PPP 3R 1 KD小鼠与eGFPCa或WTCtrl小鼠相比NREMS显著减少。从清醒到NREMS和从NREMS到NREMS的转换概率降低，而从NREMS到清醒和从清醒到清醒的转换概率增加。           

• 研究意义  

作者证明了生化纯化和化学生物学在发现影响睡眠重要的分子方面的有效性。基因方法虽然强大，但需要整个动物来发现与睡眠有关的基因。生物化学可以在体外应用于分子，而不是动物，因此它可以在更小的反应体积中进行。从生物化学中发现的分子可以在体内测试对睡眠的功能影响。体外分子方法可能会促进睡眠研究，并改变寻找影响睡眠的药物的方法。    

在这里，作者率先应用生物化学和化学生物学方法来研究睡眠调节机制。钙调神经磷酸酶（CaN）是一种磷酸酶，能在两个调节位点上使SIK 3去磷酸化，但不是酶活性所需的位点。减少CaN可以减少睡眠超过5小时，标志着在小鼠中观察到的最显着的睡眠表型。本研究揭示了磷酸酶-激酶通路在睡眠调节中的作用，强调了生化纯化和化学生物学方法是对脑功能研究有价值的有效技术。

总结

对睡眠机制的研究传统上依赖于电生理学和遗传学。由于睡眠只能通过行为观察和物理手段对整个动物进行测量，因此没有通过生物化学和化学生物学方法进行睡眠研究的试验。作者使用磷酸化位点的激酶作为研究睡眠的生化和化学生物学方法的目标。在盐诱导激酶3（SIK3）的残基T469处携带苏氨酸至丙氨酸取代的小鼠的睡眠增加。作者的生化纯化和光交联显示，在体外和体内，SIK 3在T469和S551处发生钙调神经磷酸酶（CaN）去磷酸化，但在T221处没有发生。敲低CaN调节亚基减少每天睡眠超过5小时，超过所有已知的小鼠突变体。作者的工作揭示了CaN在睡眠中的关键生理作用，并开创了生化纯化和化学生物学作为研究睡眠的有效方法。    

https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2024.12.003