文献解读｜FSH糖型异质性对生殖功能的影响及其带来的临床应用展望

促卵泡激素（FSH）是一种由垂体前叶分泌的促性腺激素，由 α 亚基和 β 亚基组成的异二聚体糖蛋白，其对女性生殖至关重要。所有糖蛋白激素的 α 亚基相同，而 β 亚基决定促性腺激素的生物学特异性^[1]。FSH 蛋白分子共有四个 N-链接的糖基化位点，分别分布在 α 亚基（包含2个糖基化位点：Asn⁵²和Asn⁷⁸）和 β 亚基（包含2个糖基化位点：Asn⁷和Asn²⁴）的氨基酸链上。α 亚基的糖基化位点均被聚糖占据，而 β 亚基上的糖基化位点 Asn⁷ 和 Asn²⁴ 可能被聚糖占据，也可能不被聚糖占据。根据 β 亚基的糖基化位点占据情况，即修饰程度不同，FSH 具有四种糖型：完全糖基化的 FSH²⁴，低糖基化的 FSH¹⁸（缺失Asn⁷聚糖）、FSH²¹（缺失Asn²⁴聚糖）和 FSH¹⁵（缺失Asn⁷聚糖和Asn²⁴聚糖）这四种异构体^[2]。随着年龄的增长，低糖基化的 FSH²¹ 和 FSH¹⁸ 分泌逐渐减少，因而，绝经后女性分泌的 FSH 中 FSH²⁴ 占比增加^[1]。

2023 年在 Development 发表的一篇题为「Oocyte quality is enhanced by hypoglycosylated FSH through increased cell-to-cell interaction during mouse follicle development」的研究，基于一种体外小鼠卵泡生长系统来评估 FSH²¹ 和 FSH²⁴ 对卵泡生长和卵母细胞质量的直接影响^[1]。

该研究旨在评估为期 12 天的培养过程中不同浓度（1 ~ 100 ng/ml）FSH²¹和FSH²⁴对卵泡生长和存活的直接影响。结果发现：FSH²¹通过在卵泡生长早期增加细胞间的信号传导，促进卵泡生长，并改善了卵母细胞质量，而随着生殖衰老，体内 FSH²¹ 向 FSH²⁴的丰度转变可能导致卵母细胞质量的年龄依赖性下降。

相较于 FSH²⁴，FSH²¹增强了次级卵泡的存活和生长

为了确定 FSH 糖型对卵泡存活和生长的影响，分别在含有两种不同浓度（1和10 ng/ml）FSH 糖型的培养基以及不含 FSH 的培养基（对照）中培养早期次级卵泡。培养到第 12 天时，除 1 ng/mL FSH²⁴组（存活率：43 ± 34.45%）和对照组（存活率：0%）外，所有糖型培养组的存活率均保持在 70% 以上。

与相同浓度的 FSH²⁴ 相比，经 10 ng/mL FSH²¹ 培养的卵泡在第 6 天、第 8 天和第 12 天的直径分别增加了 1.56 倍、1.28 倍和 1.18 倍。

*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001

图1 从D0培养D6，D8和D12的卵泡生长情况^[2]

与 FSH²⁴相比，FSH²¹介导了更多的卵泡雌二醇分泌

与其他培养组相比，10 ng/mL FSH²¹培养组观察到雌二醇分泌增加（第8 ~ 12天）；其中在第 8 天和第 12 天，FSH²¹培养组的雌二醇水平分别比 FSH²⁴培养组高出 13.4 倍和 4.5 倍。

FSH²¹提升了卵子质量

为确定 FSH²¹介导的卵泡生长和雌二醇生成的增加是否可转化为卵子质量的改善, 研究者评估了体外培养的卵泡中, 卵母细胞在体外排卵信号刺激下产生 MII 卵子的能力（由于1 ng/mL FSH²⁴培养组的卵泡生长和存活率较差，研究者仅评估了在 10 ng/mL FSH²¹和 FSH²⁴条件下培养的卵泡）。结果发现，与经 FSH²⁴培养的卵泡相比，FSH²¹培养组的卵泡中有更高比例的 MII 卵子表现出正常的 MII 纺锤体结构（76.32% vs 50%）。

两种 FSH 糖型都支持生成具备减数分裂能力配子的卵泡，但经 FSH²⁴培养的卵泡更易产生染色体和纺锤体缺陷的卵子，从而影响卵子质量和发育潜力。

FSH²¹在不依赖于卵泡生长的情况下增加了细胞间的缝隙连接

跨区投射（TZPs）是由颗粒细胞（GC）产生的胞质投射，通过由连接蛋白 37（由 Gja4 编码）组成的缝隙连接建立卵母细胞与 GC 之间的信号转导。此外，连接蛋白43（由Gja1编码）在卵泡 GC 之间建立缝隙连接。TZP 数量和连接蛋白表达与卵母细胞和卵泡大小呈正相关，FSH 是已知的小鼠卵泡中连接蛋白表达和 TZPs 调节因子。因此，研究者推测不同 FSH 糖型在卵泡建立 TZPs 和缝隙连接的能力上会有不同的影响，而这可能带来卵泡生长和卵母细胞质量的差异。为此，早期次级卵泡分别经 1 或 10 ng/mL的 FSH 糖型培养 24 小时，然后进行肌动蛋白染色（大多数 TZPs 基于肌动蛋白）。

在透明带区域，10 ng/mL FSH21 培养组的卵泡肌动蛋白染色显著高于所有其他培养组，相比相同浓度的FSH²⁴培养组增加了 1.6 倍。这些数据表明 FSH²¹刺激了早期卵母细胞-GC 和 GC-GC 之间的连接，这种连接在卵泡生长之前发生，但可能由于增强的细胞间信号传导赋予了卵泡在后续生长上的优势。

FSH²¹通过缝隙连接介导机制促进 GC 之间的信号传导，从而增强卵泡生长和卵母细胞发育

为了确定卵泡内细胞之间的增强互动是否促进了卵泡生长，研究者对经 10 ng/mL FSH²¹和 10 ng/mL FSH²⁴培养 24 小时后的卵泡 GC 进行了 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）染色，以作为细胞增殖的早期指标。与对照组相比，卵泡经 FSH²¹和 FSH²⁴ 培养后，EdU 标记的 GCs 数量分别增加了 2.4倍 和 1.6倍（前者比后者高出 1.5 倍）。

鉴于相比 10 ng/mL FSH²⁴培养组，10 ng/mL FSH21 培养组可增加 TZPs、GC 特异性缝隙连接及 GC增殖水平，研究者进一步探讨了细胞间信号转导是否直接调节 FSH²¹的增殖能力。用10 ng/mL FSH²¹与广谱缝隙连接抑制剂卡贝诺洛酮 (CBX) 共同培养卵泡后，FSH21 促进 GC 增殖的作用消失，EdU 标记水平与对照组相似。单独使用抑制剂的培养组与对照组相比，EdU 标记的 GCs 比例没有显著差异。这表明FSH²¹通过缝隙连接依赖机制介导了 GC 的增殖。

为确定 FSH²¹在 24 小时内诱导的缝隙连接依赖的早期增殖是否影响了长期的卵泡生长轨迹和卵母细胞发育结果，研究者进行了 FSH²¹与 CBX 共同培养的 24 小时实验；之后，卵泡在剩余的长期培养期间仅用 FSH²¹进行培养。值得注意的是，短期 CBX 培养并未影响卵泡的存活率（第10天的存活率为 92 ± 6.9%，而 FSH²¹对照组为 95 ± 6.6%），表明短期 CBX 培养对卵泡无毒性。培养第 10天 时，FSH²¹与短期 CBX 共同培养组的卵泡显著小于 FSH²¹单独培养组的卵泡（从105.2 ± 9.6 um增长到182 ± 35.6 um vs 从106.3 ± 8.6 um增长到205.1 ± 37.2 um）。培养第 9 天时，在经 CBX 短期培养的卵泡培养基中，雌二醇水平也降低。最后，CBX 短期培养导致出现纺锤体和/或染色体排列异常的 MII 卵子比例增加。这些发现表明，FSH²¹对卵泡生成和卵母细胞发育的积极影响依赖于细胞间信号传导的早期建立。

上述动物研究表明，与完全糖基化的 FSH²⁴相比，低糖基化的 FSH²¹在促进卵泡生成和改善卵子质量方面更为有效。在机制上, FSH²¹通过早期建立缝隙连接来介导细胞间的相互作用，增强了 GC 的增殖、卵泡生长及功能。相应地，卵子质量也有所提高，表现为更高比例的成熟卵子（具有正常的减数分裂纺锤体和染色体排列）（图2）。

图2 不同 FSH 糖型对体外卵泡生成和卵母细胞质量的影响示意图^[1]

FSH²¹通过增加卵母细胞与颗粒细胞之间的 TZPs 以及颗粒细胞之间的缝隙连接来促进早期细胞间信号转导。诱导颗粒细胞增殖增加、卵泡生长、雌二醇分泌增加，相比 FSH²⁴显著改善了 MII 卵子质量。

上述动物研究数据提示，增加 FSH²¹在 FSH 制剂中的比例可能是提高卵泡和卵母细胞发育效果的一个潜在途径。那么现有医学辅助生殖领域中使用的 FSH 制剂现状如何呢？

2023 年发表在 Int J Mol Sci 的一篇题为「Follicle-Stimulating Hormone Biological Products: Does Potency Predict Clinical Efficacy?」的综述阐述了 FSH 糖基化异质性如何影响 FSH 制剂的生物学活性，并分析了不同 FSH 制剂在人体内的药代动力学/药效学（PK/PD）和临床应答。

FSH 是一种复杂的分子，其宏观和微观异质性带来不同糖型 FSH，影响了靶细胞水平的生物效应以及血浆半衰期和清除率^[2]。

FSH 的糖基化修饰宏观异质性是指在β亚基上潜在的糖基化位点存在未被糖基化的现象，这种复杂的寡糖侧链不均一性会影响 FSH 的代谢清除率和生物活性^[3]。相比完全糖基化的 FSH，低糖基化的 FSH 具有更高的受体亲和力、体外生物学活性，同时肾脏清除率增强，半衰期也更短^[2,3]。

FSH 的微观异质性是指 α 和 β 亚基上N-聚糖结构的多样性，这种复杂的多样性可能会影响其体内生物学功能和清除速率。FSH的N-聚糖主要是复合型聚糖，一般具有2个,3个或4个糖基化分支 (又称为天线) ^[3]。有研究表明，分支末端的触角会影响 FSH 与其受体的结合: 体积大和延伸的聚糖可能导致受体反应延迟，而相对体积小而紧凑的聚糖具有更快速的受体结合能力^[3]。唾液酸基团位于N-糖链的末端，可以通过 α 2,3 或 α 2,6 连接附着在半乳糖上; 不同糖基化分支的末端唾液酸化程度存在差异, 这种修饰程度按照修饰数量可以分为中性唾液酸化、单唾液酸化、二唾液酸化、三唾液酸化和四唾液酸化糖型。在 FSH 异构体中，含较少唾液酸的异构体具有较短的血浆半衰期和较高的清除率^[4]，表现出更高的 FSH 受体（FSHR）结合亲和力^[2]。

图3 FSH 糖基化微观异质性与生物功能的关系^[2,3]

当前辅助生殖技术（ART）治疗中使用的 hFSH 制剂种类较多，包括尿促性腺激素（u-hFSH 和 hMG）、r-hFSH α 及其生物类似药、r-hFSH β 和r-hFSH δ 等。

尿促性腺激素主要由完全糖基化的（hFSH²⁴）糖型组成，高度唾液酸化（包含 α 2,3-和 α 2,6-唾液酸糖链）和高度糖基化，具有较长半衰期，但 FSHR 结合亲和力较低。原研 r-hFSH α 含约 5% 的不含唾液酸的中性 FSH 糖型，25% 的单唾液酸化 FSH 糖型，50% 的双唾液酸化 FSH 糖型，15% 的三唾液酸化 FSH 糖型，以及 < 5% 的四唾液酸化 FSH 糖型。相比尿促性腺激素，r-hFSH α 具有较短的血浆半衰期和更高的 FSHR 结合亲和力, 其在糖基化谱和聚糖种类分布方面具有高批次一致性^[2]。r-hFSH β 的糖基化谱与r-hFSH α 非常相似；但现有的已发表证据并未提供r-hFSH β 的质量与生物活性之间的换算因子。r-hFSH δ 包含 α 2,3和 α 2,6 唾液酸糖链，唾液酸化程度接近绝经期尿FSH，三支聚糖和四支聚糖比例高，相比r-hFSH α，其肾脏清除率较低，血清清除速度较慢。

临床疗效方面，相比r-h FSH α 和 r-hFSH β，相同 IU 剂量的尿促性腺激素产生的卵子数更少^[2]。Meta分析和 RCT 研究显示，在相同启动剂量下，接受原研r-hFSH α 治疗组的活产率高于生物类似药组。r-hFSH δ 则尚未建立一种可靠的方法来比较其与其他 hFSH 制剂的临床疗效，基于r-hFSH δ 个体化起始剂量和r-hFSH α 或其他促卵泡激素固定起始剂量间的比较，无法得出等效性^[2]。

根据 β 亚基糖基化修饰程度的不同，FSH 分为 FSH²⁴、FSH²¹、FSH¹⁸ 和 FSH¹⁵ 四种糖型。其中低糖基化的 FSH¹⁸/FSH²¹会随着年龄的增长会减少，绝经后女性分泌的 FSH中FSH²⁴占比增加。动物研究提示，相较 FSH²⁴，FSH²¹在促进卵泡生长、雌二醇分泌以及通过增加卵泡形成早期细胞间的信号传导来促进卵泡形成和改善卵母细胞质量方面具有优势。目前临床上应用的 FSH 制剂包括尿促性腺激素、r-h FSH α及其生物类似药、r-h FSH β 和r-h FSH δ 等，其中原研r-h FSH α 在糖基化谱和聚糖种类分布方面具有高批次一致性^[2]，其较尿促性腺激素含有更高FSH²¹异构体^[6]，这带来了更强的FSH受体亲和力[CS1] ^[2] [2]和更高的生物效能^[7]。

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