近期，苏州大学生物钟研究中心/苏州大学苏州医学院基础医学院王晗课题组在National Science Review杂志在线发表题为“The circadian clock orchestrates spermatogonial differentiation and fertilization by regulating retinoic acid (RA) signaling in vertebrates”的工作，首次揭示了生物钟在脊椎动物精巢中精子发生和受精能力上的调控作用，率先阐明了生物钟对脊椎动物雄性生殖的调节机制（图一）。
图一：精巢生物钟通过维甲酸信号调控的精子发生和受精的模式图。
地球自转产生的昼夜变化带来了光照温度等自然条件以大约24小时为周期的循环变化。各种生物包括人对这一周期性环境变化的长期适应都演化了自我维持的内在计时机制，即生物钟(circadian clocks)，以预判和协调自身方方面面的生命活动。受生物钟调控，自然界绝大多数生物均呈现以大约24小时为周期昼夜变化的生物节律（circadian rhythms）。
动物体中，自主的生物钟几乎存在于每一个细胞中，确保各个细胞在各自合适的时间协调工作，从而使全身的生理活动正常有序的进行。生物钟对诸多基本的生命过程, 如睡眠、代谢、免疫和生殖等均发挥不可或缺的调节作用。而细胞、组织或器官生物钟紊乱能够严重损害机体的健康。研究各个组织器官的生物钟对了解重要生理功能的调节机制具有重大的意义。
生殖腺作为外周生物钟研究受到了很大的关注。而精巢是否存在生物钟至今仍然尚无定论。上世界90年代末，几项研究显示核心生物钟基因在斑马鱼精巢中缺乏转录振荡 (1, 2)。随后，精巢或睾丸无生物节律也在啮齿动物小鼠和大鼠中得到证实 (3, 4)。20多年来，生物钟领域普遍认为精巢组织和细胞内不存在生物钟，并提出假说可能是由于生殖细胞的快速分化和分裂造成的(5, 6)。然而，精巢无生物钟与体内普遍存在的外周生物钟理论相悖。10多年前，王晗教授在领衔国家重大科学研究计划（973）项目“生物钟在生殖系统与发育中调节的机制（2012CB947600）”，就提出疑问，精巢中究竟是否存在生物钟活动？
首先，针对以往认为的脊椎动物精巢缺乏生物节律振荡，王晗研究团队利用斑马鱼和小鼠模型，开展了连续48小时时间序列转录组分析，惊奇地发现大约5-8%的精巢基因表达呈显著的节律，包括生物钟核心环路和生殖相关基因。有趣的是，对精子生成发生非常重要的维甲酸信号通路也呈显强烈的昼夜节律。
精巢的生物节律为何之前没有被发现？该研究进一步探索精巢中具体哪些细胞中存在生物钟活动，发现生物钟活动主要存在于仅占精巢2%左右的Sertoli支持细胞中。20多年前的斑马鱼、小鼠和大鼠研究均从整个精巢提取RNAs，利用基于杂交的方法如Northern blotting进行生物钟基因表达定量分析，因为精巢中98%细胞不存在核心生物钟基转录振荡，掩盖了仅占2%左右的Sertoli支持细胞中转录振荡，错失了揭示精巢生物钟良机。王晗实验室发现，生物钟通过控制精巢中维甲酸信号，从而调节精巢生殖功能。其中编码维甲酸合成限速酶的aldh1a2和维甲酸受体的rarga均直接受生物钟调节。
为了进一步证明破坏生物钟是否能导致精巢功能受损，研究者在生物钟突变体中进行了生殖细胞检测，发现Sertoli细胞中的生物钟在精巢功能中起到了关键的调控作用。破坏Sertoli细胞生物钟后，精原细胞分化受到明显抑制，精母细胞以及精子数量明显下降，同时发现，精子的受精能力也明显降低。
为了确定生物钟调节的维甲酸信号在其中的作用，研究者在生物钟突变体中给予维甲酸相关药物处理。他们发现在午夜ZT12单次维甲酸给药，能在生物钟突变体中明显恢复精原细胞分化，并提高精子的受精能力。结果显示单次给药并不能立刻提升精子数量。研究者发现精原细胞分化的恢复是通过抑制zbtb16a这一未分化标志基因产生的。虽然数量没有明显变化，单次给药对精子质量影响显著。而这一精子活力和受精能力的提升，并不依赖于精子数量的变化，而是在精子中表达能够识别卵子并促进精子卵子结合的基因izumo1表达提升。这一发现为生物钟调节精子发生和受精功能提供了新的机制。
除了鱼类，王晗研究团队还拓展到了哺乳动物小鼠。单细胞RNA测序发现精巢中生物钟核心基因Clock在Sertoli细胞中特异性表达。与斑马鱼物种保守的是，Sertoli细胞生物钟在小鼠精巢中也处于核心调节作用。破坏了小鼠Sertoli细胞生物钟，也导致了其精原细胞分化显著降低、精子数量下降，和精子受精能力明显降低。
除了生物钟基因敲除导致的遗传学模型，研究者也检测了长期生物钟紊乱模型。斑马鱼和小鼠在长期的生物钟紊乱后，例如连续一个月的倒时差，均导致了维甲酸合成减少、精子发生受阻、精子受精能力的显著下降。这些破坏在生物钟正常一段时间后能得到明显恢复。这些发现为现代社会中因长期熬夜、夜班或者倒时差等因素造成的雄性生殖能力衰减的诊断和治疗提供了新的依据。
亮点
该研究首次发现了精巢生物钟的存在和生物钟通过控制Sertoli支持细胞中维甲酸（RA）通路对精子生成和受精功能的特异性控制新机制（图一），终结了长达20多年来困扰生物钟领域精巢无生物钟的错误观点，展示了精巢生物钟在脊椎动物中的高度保守性，为人类男性生殖健康提供了新的研究靶点。
王晗课题组刘陶乐博士完成该研究的大部分实验，是该文第一作者，王晗教授是通讯作者。王晗课题组仲兆民副研究员、硕士生何薇、博士生卢晨晨、William Kojo Smith、吴联欣、王子铭等参加了部分实验，苏州大学特聘教授龙乔明等提供了部分小鼠模型。
该研究受到国家重点研发计划项目（2019YFA0802400 和 2018YFA0801000）, 国家重大科学研究计划（973计划）项目 （2012CB947600）, 国家自然科学基金（NSFC） 项目（31961133026, 31871187, 31030062, 81570171和81070455） 以及江苏高校优势学科建设工程等基金（PAPD）的支持。