上海交大刘倩/冯雁Trends Biotech综述丨基于CRISPR/Cas和Argonaute核酸酶的“一管式”诊断策略与展望

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2024-12-29 13:02发布于北京CellPress细胞科学官方账号

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CRISPR/Cas和Argonaute（Ago）可编程核酸酶与等温扩增技术的偶联，有效解决了等温扩增技术，如RPA、LAMP的特异性差、难以多重检测的局限性，为即时检测（POCT）提供了新的解决方案。然而，由于反应条件差异和组分的相互干扰，扩增和核酸酶反应往往需要分步进行，操作过程中途开盖容易导致扩增产物气溶胶污染，同时增加了操作复杂度。如何实现扩增-核酸酶兼容的“一管式”检测已成为基于可编程核酸酶检测技术临床应用的关键瓶颈问题。近日，上海交通大学生命科学技术学院的冯雁教授/刘倩研究员在Cell Press细胞出版社期刊Trends in Biotechnology发表了题为“One-pot diagnostic methods based on CRISPR/Cas and Argonaute nucleases: strategies and perspectives”的综述。该论文系统综述了CRISPR/Cas和Argonaute可编程核酸酶偶联核酸扩增的“一管式”分子诊断技术面临的挑战挑战，以及现有扩增-酶切“一管式”兼容反应的方法和策略，并对可编程核酸酶检测技术的未来发展方向进行了展望。

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1. 微流控芯片技术

物理隔离是实现”一管式”CRISPR检测的最直接方法，常见的方式是通过特制的隔离介质将扩增和酶切反应固定于两个腔室中，扩增后再通过手动操作将酶切体系和扩增产物混合，但这种方式仍面临试剂固定稳定性、操作复杂等挑战。微流控芯片通过集成多个反应室于单一反应载体中，通过外力驱动，实现扩增与核酸酶的物理分离反应，增强了灵敏度、多重性以及自动化水平。例如，利用重力驱动扩增产物进入Cas反应体系的DISCoVER系统，实现了对SARS-CoV-2的高灵敏度和多靶标检测。指压驱动的微流控生物传感器（FA-MB）和离心式微流控芯片提供了高效的流体处理和多重“一管式”检测新方法。尽管微流控芯片的开发复杂且成本较高，但3D打印的发展和材料成本的降低，预示着未来该方法还有更大的改进空间。

▲图1. 通过微流控芯片物理分离扩增与核酸酶反应

2. 组分优化

优化反应体系组分也是实现“一管式”CRISPR检测的重要途径，通过调整引物、crRNA、Cas蛋白、dNTPs、金属离子等组分浓度，或者在反应缓冲液中增加额外辅助因子，如RNase H、RNase inhibitor，可以调控扩增和Cas酶切效率之间的平衡，改善体系之间的干扰，提高灵敏度和检测效率。例如，STOPCovid V2优化了Cas酶切体系的所需的组分，并系统筛选了缓冲液成分，实现了对SARS-CoV-2的高灵敏度检测。此外，选择与Cas蛋白反应条件更兼容的扩增系统，如转录介导扩增（TMA）和滚环扩增（RCA），也可以实现有效的”一管式”检测。通过标准化、流程化的实验设计（DOE）可以最大限度地提高优化效率。组分优化虽然无需专门的耗材和仪器设备设计，但由于不同的靶标扩增和酶切的效率不尽相同，因此，优化过程仍然复杂，且优化体系的通用性还需要更大量的靶标进行进一步验证。

▲图2. 优化反应组分实现“一管式”检测

3. Cas蛋白的挖掘与改造

Cas蛋白的挖掘和改造，可以得到对扩增体系耐受度更高的新型Cas蛋白，特别是增强其热稳定性，是Cas蛋白重要的改进方向。新型热稳定Cas蛋白（如AacCas12b和BrCas12b变体）能够耐受更高温度，使其能与LAMP扩增技术的反应条件兼容。此外，通过人工智能和机器学习的蛋白突变体构建，可以提高热稳定性，减少非特异性模板DNA结合能力，以提高检测的灵敏度和鲁棒性。随着蛋白质结构-功能关系的不断阐明和高通量蛋白筛选技术的发展，通过定向进化改造Cas蛋白的活性可能成为提高“一管式”检测效率的重要途径。

4. 向导RNA的修饰

通过修饰向导crRNA来调控Cas12a活性，是实现“一管式”检测的另一种方法。光控阻断核酸、次优PAM和无PAM设计有助于解决核酸提前被Cas12a切割的问题，减少Cas蛋白对扩增体系中引物和模板的干扰，提高整体效率和灵敏度。

▲图3. 通过Cas蛋白和crRNA改造实现“一管式”检测

5. 基于Ago的“一管式”检测技术

与CRISPR技术相比，基于Ago的检测技术仍处于早期阶段，但依靠其短链ssDNA引导链和单酶靶标检测的特点，已展现出重要的应用潜力。利用嗜热Ago蛋白的独特性质，结合物理隔离的定制耗材，SPOT系统实现了温控的“一管式”检测，同时，另一种OPTIMAL系统则开发了热激活固定化Ago酶，实现了在常规反应管内扩增和酶切反应的分步启动。这些创新为核酸检测提供了经济高效且稳健的解决方案，并有望扩展到更多的POCT应用场景检测中。

▲图4. 基于嗜热Argonaute热激活的“一管式”检测

总结与展望

基于CRISPR和Ago的“一管式”检测技术在传染病诊断、环境监测、农业等领域展现出广阔应用前景。尽管潜力巨大，但仍需克服专用设备耗材、优化复杂和通用性验证等挑战。未来研究将聚焦于新型酶的发掘、酶制剂可控性的提升以及配套设备的微型化、自动化。人工智能、蛋白质工程和电化学生物传感器的发展将进一步改善开发周期、酶学性能和易用性，推动“一管式”检测技术的演进，并在即时检测领域开发更高效、更灵敏和更友好的下一代分子诊断工具。

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