日前，江雷院士团队揭秘白酒为什么要温着喝，而啤酒或白葡萄酒冷藏后风味更佳（详细报道：同样是喝酒，院士团队，喝出一篇顶刊！）。近日，针对酒精饮料的分析，南京大学黄硕教授团队成果再次登上顶刊Matter，这项成果市场前景广阔。酒精饮料的纳米孔特征
酒精饮料，例如葡萄酒、啤酒和蒸馏酒，在不同国家广泛生产和消费。不同类型的酒精饮料含有不同的风味化合物组合。然而，通过微型便携式设备对酒精饮料中的多种化合物进行快速、同步分析仍然是一个挑战。
鉴于此，南京大学黄硕教授团队应用了经苯硼酸（PBA）适配器修饰的分枝杆菌孔蛋白 A（MspA）纳米孔，用于快速分析各种酒精饮料。利用定制的机器学习算法，可同时识别蒸馏和发酵酒精饮料中的各种顺式二醇，并为每种样品类型生成独特的条形码。对酒精饮料的纳米孔分析以前也从未进行过。此外，还演示了葡萄酒甜度的快速分级和添加剂（包括蔗糖和 D-酒石酸）的检测，展示了该技术在葡萄酒生产管理中的重要意义。相关研究成果以题为“Nanopore signatures of major alcoholic beverages”发表在《Matter》上。
示意图 1. 酒精饮料的纳米孔分析
【乙醇耐受性测试和纳米孔筛选】
第一个实验挑战是确保纳米孔在富含乙醇的环境中的稳定性。研究人员在 1.5 M KCl 缓冲液中使用 M2MspA 突变体纳米孔，通过增量添加乙醇来确认稳定性。该系统在乙醇浓度高达 60 µL 的情况下未表现出变性或脂质双层破坏，验证了其在不去除乙醇的情况下进行直接样品分析的稳健性。为了确定用于饮料传感的最佳纳米孔-适配器组合，该研究将 M2MspA 和野生型 α-溶血素 (α-HL) 纳米孔与三种修饰纳米孔进行了比较：MspA-90PBA、MspA-NTA-Ni 和 MspA-NTA-Cu 。其中，MspA-90PBA 在分析半甜白葡萄酒时表现出优异的灵敏度和事件多样性，揭示了其检测多种小分子（如糖类和 α-羟基酸）的能力。这使得MspA-90PBA成为后续实验的主要焦点。关键发现（1）稳定性确认：添加乙醇对开孔电流没有不利影响（图1A、1B）。（2）纳米孔适用性：与其他纳米孔不同，MspA-90PBA产生了独特的特征事件（图1C-G）。
图 1. 酒精耐受性测试和用于酒精饮料分析的潜在纳米孔筛查乳酸(LA)，特别是其对映体L-LA和D-LA，显着影响饮料口味。该研究使用MspA-90PBA根据纳米孔事件特征区分这些对映体。利用Xgboost机器学习模型，研究人员实现了100%的分类准确率，并通过清晰的散点图区分L-LA和D-LA。对中国白酒、白兰地、威士忌、朗姆酒、伏特加和杜松子酒等蒸馏饮料的测试显示，DL-LA比例不同。例如，中国白酒样品表现出明显的对映体差异，而朗姆酒、伏特加和杜松子酒由于其成分而没有显示出可测量的LA。中国白酒显示出清晰的DL-LA聚类，而白兰地和威士忌则呈现噪声事件，可能是由于在橡木桶中陈酿所致（图2F-K）。混淆矩阵验证了Xgboost模型在识别LA对映体方面的准确性（图2C）。图 2. 利用 MspA-90PBA 鉴定蒸馏酒精饮料中的 L/D-LA作者将MspA-90PBA的传感能力扩展到发酵饮料中常见的化合物，如甘油、苹果酸和葡萄糖。利用提取的纳米孔事件特征（如电流阻塞深度、标准偏差），随机森林模型的分类准确率达到99.55%。对六种分析物的同时检测证明了该模型自动标记和预测事件的能力，突出了它在复杂饮料基质中的实用性。每种分析物都会产生不同的事件模式，形成机器学习模型的基础（图3A-G）。训练有素的随机森林分类器在测试集上的准确率超过97.5%（图3H-I）。图 3. 用 MspA-90PBA 鉴定发酵酒精饮料中的顺式二醇作者对红葡萄酒、白葡萄酒和啤酒的直接纳米孔分析揭示了每种饮料的独特事件“条形码”，从而实现了明确的区分。例如，白葡萄酒中的D-果糖和D-葡萄糖频率与甜度水平相关。有趣的是，还发现了未知事件群（“U事件”），可能与未表征的化合物相对应。主要发现在于（1）事件多样性：每种饮料都显示了公认事件（L-LA、D-LA等）和未知事件的独特组合（图4A-K）。（2）定量指标：事件频率为每种饮料提供了详细的成分指纹（图4C、F、I、L）。纳米孔传感将葡萄酒的甜度与D-果糖事件频率直接联系起来。在干型、半干型、半甜型和甜型白葡萄酒中，半甜型样品显示出独特的U5和U6事件群。D果糖事件频率的增加反映了葡萄酒从干到甜的过程（图5B-F）。U5事件是区分半甜葡萄酒的标志（图5E）。这种方法为甜度分级提供了一种快速、定量的工具。蔗糖和D-酒石酸（D-TA）等非法添加剂会损害葡萄酒的质量和安全。通过在半甜白葡萄酒中添加这些添加剂，MspA-90PBA可以检测到它们的存在，并以极高的灵敏度（LOD：蔗糖为20毫克/升，D-TA为0.3毫克/升）对其浓度进行量化。总的来说，蔗糖和D-TA事件截然不同，并能准确识别（图6B、D、G）。就校准和准确性而言，测量浓度与真实值非常吻合，验证了该方法的有效性（图6H）。这项研究证明了工程纳米孔，特别是MspA-90PBA在酒精饮料分析中的变革潜力。通过生成事件条形码，这些传感器可实现快速、便携和高分辨率的饮料鉴别、甜度分级以及非法添加物检测。机器学习集成进一步提高了自动化和精确度。未来的发展方向包括扩展传感数据库，探索其他孔隙适配器组合，以及集成便携式设备用于现场饮料质量控制。这项技术代表了饮料分析领域的重大飞跃，为质量保证和监管合规提供了可扩展的解决方案。黄硕，南京大学化学化工学院教授、博士生导师，生命分析化学国家重点实验室，南京大学化学和生物医药创新研究院（ChemBIC），国家自然科学基金杰出青年（2022年），国家海外引才（青年）（2015年），江苏省“杰出青年”（2020年），江苏省“双创团队”领军人才（2020年），江苏省“双创人才”（2017年）。