减毒活疫苗的病毒减毒策略

减毒活疫苗是指病原体经过各种处理后，发生变异，毒性减弱，但仍保留其免疫原性。将其接种到身体内，不会引起疾病的发生，但病原体可在机体内生长繁殖，引发机体免疫反应，起到获得长期或终生保护的作用。

在传统疫苗特别是病毒性疫苗中，减毒活疫苗是研制的主导方向。麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、水痘疫苗、风疹疫苗等都属于减毒活疫苗。接种减毒活疫苗后，减毒的病原体在机体内有一定程度的生长繁殖能力，类似于隐性感染产生细胞、体液和局部免疫，所以应用于减毒活疫苗的菌、毒种均为弱毒。

研发减毒活疫苗的关键是选育减毒适宜、毒力低而免疫原性和遗传稳定性均良好的菌、毒种。

体内、外传代减毒

卡介苗是传统传代方法筛选细菌疫苗株的典型例子。法国巴斯德研究所的Calmette和Guerin将牛型结核杆菌接种在5%的甘油胆汁马铃薯培养基上，每隔2~3周传代1次，经传230余代，历时13年，使其致病力丧失而仍保持免疫力，终于开发了预防结核病的卡介苗（BCG vaccine）。

风疹病毒的减毒过程较简易，系采用体外连续传代培养结合温度筛选法进行减毒。以人二倍体细胞从一典型风疹女孩的咽拭子中分离病毒，经鉴定确认后在36℃培养下连续传代11代，使病毒适应人二倍体细胞（HDC）。而后在低温（30℃）培养下连续传代（低温培养可加速病毒减毒过程）。在低温培养下经传12代获得减毒株，定名为BRDⅡ株。临床研究表明，BRDⅡ株风疹疫苗接种于人体后反应轻微、免疫原性良好，受种者由咽部可排出有限病毒，但无传播性。

采用体内外培养法减毒，可能获得毒力低和毒力强的混合病毒液，需采用空斑挑选或终末稀释法对毒力已减弱的病毒液进一步纯化筛选，使弱病毒更均一、毒力特性更强。

低温培养筛选

将病毒接种细胞后可置36~37℃温度下培养。为逐步适应可分步降低培养温度，如36~37℃培养一定代次后改为33℃培养，最后降至30℃和更低的培养温度，可降低病毒毒力。病毒经长期低温培养适应后称为冷适应毒株，此毒株在低温培养下能正常复制，但在38~39℃培养下病毒复制受限。在体外培养时，低温培养的病毒滴度低于高温培养（38~39℃）2个对数时称温度敏感特征。冷适应株和某些具有温度敏感特征的毒株在体内37℃或更高温度下，病毒仅是有限复制，对人或动物无致病性，但仍可诱导机体产生免疫应答，因此可用于制备疫苗。

诱变减毒

应用化学或物理方法的诱变使细菌或病毒的基因发生改变，通过筛选可获得毒力减弱的弱毒株。如我国使用的人用炭疽皮肤划痕活疫苗弱毒株是炭疽野毒株A16经紫外线照射诱变后在含血清培养基上选育得到的无荚膜水肿型A16R弱毒株。

定点突变与基因截断

根据基因序列上特定核苷酸以及基因序列长度与病毒独立的相关性，通过定点突变和截断基因使病毒毒力减弱，同时保持保护性免疫原性。

例如通过PCR技术在包含适应性突变的甲型或乙型流感病毒中缺失NS1基因，可获得一种更安全、免疫原性更广泛的减毒流感活病毒，并且病毒能在常规疫苗生产系统中复制，而被大规模生产。

基因组重排

基因结构重排的机制是一种DNA双链断裂(double-stand break)的修复过程，在等位基因内或等位基因之间，出现了重复单位复杂的转换式移动。它可以改变基因组组织排列而不改变蛋白质序列。由于基因组重排，病毒恢复到野生型的概率很低，并能防止疫苗株与野生型毒株之间发生基因重组，从而提高疫苗的安全性。此外，病毒基因组的重排不影响病毒蛋白的抗原性，表达额外抗原的重排病毒可作为二价减毒活疫苗来抵御多种毒株。

密码子去优化与密码子对去优化

密码子的简并性允许多个三联密码子编码相同的氨基酸，同义密码子在不同生物体的基因中并非随机分布，每种生物体似乎更偏爱1组不同的密码子，这种现象就是密码子偏好性。密码子偏好在转录、mRNA 稳定性、翻译效率和准确性以及蛋白质的结构、表达、功能和折叠等多种细胞过程中发挥重要作用。密码子偏好在基因工程或重组DNA技术中一个重要的应用就是对外源基因进行密码子优化，以提高外源基因的表达。相反地，用同义次优密码子替换野生型密码子，通常被定义为密码子去优化，会降低蛋白的表达，可能导致病毒适应性的大幅降低，在体外和体内均减毒。因此，将病毒基因重新编码和合成为减毒活疫苗的研制和病毒致病 分子机制的研究创造了平台。

单周期感染病毒

使用分子生物学技术对病毒组分进行突变、删除或替换可产生单周期感染病毒（single-cycle infectious virus），这些病毒可能在病毒基因组合成、组装或病毒颗粒释放方面存在缺陷，初次感染后缺乏传播能力。它们在表达缺失基因产物的互补细胞系中繁殖，而在正常细胞系中，它们表达病毒基因产物，但不复制形成子代病毒粒子。单周期感染病毒已被描述和应用于多种体外和体内实验，如片段掺入和包装信号的研究、中和试验、中和抗体或抗病毒药物的筛选、耐药性、HA 互补、蛋白功能分析或疫苗开发。

过早终止密码子携带病毒

通常情况下，核糖体通过三联密码子与匹配的氨基酰化tRNAs互补将基因组序列翻译成多肽。三联密码子UAG 不编码氨基酸，通常是翻译终止信号或终止密码子，致新生多肽合成的终止。遗传密码扩展（ge‐netic code expansion，GCE）技术源自巴氏甲烷菌（Methanosarsina barkeri）的正交翻译系统，通过Mb吡咯赖氨酰tRNA合成酶/tRNACUA对（Mb‐pylRS/tRNACUA）和非天然氨基酸 （unnatural amino acid，UAA）的协作，UAG 终止密码子可以被通读，精确控制过早终止密码子（premature termination codons，PTCs）携带病毒的复制。

GCE技术可以产生活的但不能复制的病毒，避免了传统减毒的不可预测性。该技术的决定性关键步骤是将 UAA 纳入所需 PTC 位点的有效性，然而，在一些被测试的病毒中，该有效性似乎非常低，这可能限制了该项技术的广泛应用。

蛋白降解靶向嵌合病毒

通过靶向泛素-蛋白酶体系统在翻译后水平调控蛋白浓度，通常含有一个与E3泛素连接酶配体连接的靶蛋白配体，将靶蛋白招募到E3连接酶上，诱导其泛素化和降解。蛋白降解靶向技术主要用在癌症治疗领域，还作为一种抗病毒方法降解病毒或宿主相关蛋白，以用于治疗致病性病毒感染，包括乙肝病毒 、丙肝病毒 、人巨细胞病毒 、SARSCoV-2。

高度干扰素敏感病毒

Ⅰ型干扰素（typeⅠinterferon，IFN-Ⅰ）系统是先天免疫应答的主要组成部分。IFN反应通过诱导干扰素刺激基因的表达提供抵抗病毒感染的第一道防线，还在树突状细胞的成熟、B 细胞和T细胞的发育、记忆的形成、先天免疫和适应性免疫的桥接等方面发挥至关重要的作用。为了对抗干扰素反应，许多病毒编码抑制IFN-I产生和/或信号传导的蛋白质。因此，系统地消除病毒的干扰素调节功能为疫苗开发提供了一种潜在的方法。

活的减毒 RNA 杂交疫苗

新报道的一种活的减毒 RNA 杂交疫苗技术（live-attenuated RNA hybrid vaccine tech‐nology），使用先进的耐热性 RNA 疫苗递送技术，将体外转录产生的高度减毒的 CHIKV 全长基因组与 纳 米 结 构 的 脂 质 载 体 （nanostructured lipid carrier， NLC）络合递送到接种部位 。单次 免 疫C57BL/6 小鼠可诱导高的 CHIKV中和抗体效价，并可预防致死性 CHIKV攻击后的死亡和足垫肿胀。

这种活的减毒 RNA 杂交疫苗通过单次肌内注射接种，使疫苗给药的便利性和可靠性得以提升，并且在临床环境中更易于采用；使用直接来自质粒的体外转录产物可为病毒基因组带来更好的遗传稳定性和安全性，避免遗传漂变。该技术可应用于其他正链RNA 病毒的疫苗开发，允许在无细胞环境下进行即时生产，将核酸疫苗生产中固有的易用性、可靠性和安全性与已证实的减毒活疫苗的免疫原性结合起来，有望避免传统减毒活疫苗的一些生产和安全性方面的挑战。作为一个与序列无关的过程，该技术允许使用高度减毒的病毒株，从而增加了疫苗减毒的遗传稳定性和安全性。