利奈唑胺影响MEG-01巨核细胞增殖及血小板前体生成的代谢组学研究
根据“2.2”项下方法进行细胞分组与处理。因前期实验已证实，细胞于分化培养基中培养14 d后，DMSO对巨核细胞增殖及伪足的生成无显著影响，故本研究仅取溶剂对照组和LZD组细胞（各取6×105个）进行代谢组学研究。用预冷生理盐水洗涤细胞2次，用400 μL冷甲醇-乙腈（1∶1，v/v）提取细胞中代谢产物。在4 ℃下，以14 000×g离心20 min，收集上清液并干燥，然后再溶解于100 μL乙腈-水（1∶1，v/v）溶液中。样品送往上海中科新生命生物科技有限公司，由其运用液相色谱-串联质谱技术完成非靶向代谢组学和靶向能量代谢组学检测。在非靶向代谢组学检测过程中，首先进行主成分分析，从总体上确定两组间存在显著差异；而后以变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值≥1、P＜0.05且差异倍数≥1.2或者差异倍数≤0.83为标准，进行差异代谢产物筛选；最后，利用京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库对差异代谢产物进行通路富集分析。根据非靶向代谢组学检测结果，进一步进行靶向能量代谢检测分析，并计算细胞能量代谢相关产物的相对含量。
为评估外源性丙酮酸对细胞增殖及血小板前体生成的影响，将MEG-01细胞分别接种于分化培养基和增殖培养基中，并均分为溶剂对照组（4‰DMSO）、丙酮酸组（10 mmol/L丙酮酸）、LZD组（400 μg/mL LZD）、LZD+丙酮酸组（10 mmol/L丙酮酸+400 μg/mL LZD）并作相应处理，每组设置5个复孔。细胞于增殖培养基中培养4 d后进行细胞计数；于分化培养基中培养14 d后进行细胞内丙酮酸相对含量测定（方法同“2.4”项下），并观察血小板前体生成情况（方法同“2.2”项下）。
使用SPSS 27.0软件对实验数据进行统计分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
光镜下观察结果显示：与空白对照组比较，溶剂对照组细胞的增殖未受到明显影响，但LZD组细胞增殖受到了明显抑制，且抑制作用随着药物浓度的增加而增强，见图1。各组细胞计数及CCK-8实验结果显示：与空白对照组比较，溶剂对照组细胞计数及细胞增殖活力差异均无统计学意义（P＞0.05）；100、200、400、800 μg/mL LZD组细胞计数均显著减少（P＜0.01），800 μg/mL LZD组细胞增殖活力显著降低（P＜0.01）。结果见表2。
与空白对照组比较，溶剂对照组生成伪足的细胞比例、伪足相对长度差异均无统计学意义（P＞0.05）；400 μg/mL LZD组生成伪足的细胞比例显著降低（P＜0.01），且伪足相对长度显著减少（P＜0.01）。结果见图2、表3。
qRT-PCR实验结果显示，400 μg/mL LZD处理后细胞中CD41、CD42b mRNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）（具体结果略）。
主成分分析结果显示，与溶剂对照组比较，400 μg/mL LZD组细胞的代谢谱发生了显著变化（图3A）。400 μg/mL LZD组细胞内41种代谢产物含量显著升高（P＜0.05），134种代谢产物含量显著降低（P＜0.05），详见图3B、图3C。对显著性差异代谢产物进行KEGG代谢通路富集，结果显示，包括mTOR信号通路（mTOR signaling pathway），丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（alanine，aspartate and glutamate metabolism），癌症的中心碳代谢（central carbon metabolism in cancer）等与能量代谢相关的途径受到了显著影响，详见图3D。
靶向能量代谢检测分析结果显示，与溶剂对照组比较，400 μg/mL LZD组细胞中能量物质三磷酸腺苷（adeno- sine triphosphate，ATP）、鸟苷三磷酸（guanosine tri-phosphate，GTP）相对含量显著减少（P＜0.01）；糖酵解过程产生的中间产物——丙酮酸相对含量显著减少（P＜0.01），乳酸（lactic acid，LA）相对含量显著增加（P＜0.01）。结果见表4。
与溶剂对照组比较，丙酮酸组细胞中丙酮酸相对含量、细胞计数、生成伪足的细胞比例、伪足相对长度差异均无统计学意义（P＞0.05），LZD组细胞中丙酮酸相对含量、细胞计数、生成伪足的细胞比例及伪足相对长度均显著降低/减少（P＜0.01）。与LZD组比较，LZD+丙酮酸组细胞中丙酮酸相对含量、细胞计数、生成伪足的细胞比例、伪足相对长度均显著升高/增加（P＜0.01）。结果见图4、表5。
以巨核细胞为起点的血小板生成过程涉及巨核细胞的增殖、血小板前体的生成和脱落释放。临床研究表明，部分LIT患者伴有全血细胞减少的骨髓抑制表现，因此LIT的发病机制可能与骨髓抑制造成巨核细胞减少有关。本研究结果表明，LZD可抑制巨核细胞增殖，且这种抑制作用具有浓度依赖性趋势，这与临床研究中LIT发病率与LZD谷浓度呈正相关的现象一致，说明在LZD临床使用中合理控制药物剂量和用药时间进而避免药物蓄积很有必要。此外，本研究还发现，高浓度（800 μg/mL）的LZD会直接损伤巨核细胞的增殖活力，但在正常的临床使用中LZD血药浓度无法达到800 μg/mL，因此，笔者认为这种损伤作用与LIT的发生无关。为避免干扰，笔者在后续的实验中设置LZD浓度为400 μg/mL。
有研究报道，在对LIT患者进行骨髓活检时发现了足量且形态正常的成熟巨核细胞，说明LZD在成熟巨核细胞向后分化的某个环节也发挥作用。本研究在预先添加TPO的分化培养基中进行细胞培养并观察伪足生成情况。结果表明，400 μg/mL LZD可显著抑制巨核细胞伪足生成。此外，qRT-PCR实验结果显示，400 μg/mL LZD处理后细胞中CD41、CD42b的mRNA表达水平均无显著变化。上述结果提示，LZD可抑制血小板前体的生成但不影响CD41和CD42b的表达。
既往研究发现，血小板的生成过程与线粒体能量代谢密切相关。LZD会造成线粒体损伤，进而引起能量代谢异常，但关于LZD对巨核细胞代谢影响的研究相对较少。本研究通过非靶向代谢组学分析表明，LZD改变了MEG-01巨核细胞代谢谱，且丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，癌症的中心碳代谢等与能量代谢相关的途径受到了显著影响。进一步的靶向能量代谢检测分析结果也显示，与溶剂对照组比较，400 μg/mL LZD组细胞中ATP、GTP和丙酮酸相对含量减少，LA相对含量增加。以上结果表明，LZD干扰了巨核细胞线粒体能量代谢。结合相关文献，笔者推测能量代谢的异常可能是LZD造成细胞增殖和血小板前体生成减少的原因。在糖酵解过程中，丙酮酸是PEP的下一步产物，本研究检测到给药组细胞中丙酮酸相对含量减少，但PEP的相对含量没有减少，说明LZD导致血小板生成减少的作用可能发生在PEP生成丙酮酸这一阶段，后期将进行进一步研究以明确LZD抑制PEP转化生成丙酮酸的相关机制。
丙酮酸在能量代谢过程中扮演着重要角色，其既是糖酵解的最终产物，也是三羧酸循环的起始底物。在本研究中，通过LZD对MEG-01巨核细胞代谢谱的影响研究发现，LZD会引起巨核细胞能量代谢异常，丙酮酸生成减少。既往研究表明，LZD会抑制辅助性T细胞17线粒体的翻译，破坏线粒体活性和能量代谢，造成丙酮酸生成减少，同时引起细胞因子——白细胞介素13、白细胞介素17生成减少；而补充丙酮酸可调节细胞能量代谢并恢复细胞因子的生成。此外，本研究也证实，通过补充丙酮酸可以恢复巨核细胞的增殖和血小板前体的生成。以上结果表明，丙酮酸在LZD导致的巨核细胞增殖减少和血小板前体生成障碍中具有关键作用。
综上所述，LZD可能通过抑制线粒体能量代谢导致丙酮酸生成减少，进而抑制巨核细胞增殖和血小板前体生成，最终导致LIT的发生。本研究结果对inlinegraphic唑烷酮类药物的研发和临床应用具有重要意义，但因未进行体内实验，明确该机制仍需进一步的实验验证。此外，本研究为进一步研究LIT的致病机制提供了参考。