HIV-1引发的持续性感染中，携带复制能力却转录沉默的整合前病毒细胞在长期抑制性联合抗逆转录病毒治疗（cART）期间持续存在，并在治疗中断后引发病毒反弹。cART虽为一种极为有效的治疗手段，对HIV感染者（PWH）带来诸多益处，但其无法根治感染，因其未能触及HIV-1的潜伏库。因此，PWH需终身接受cART，而药物毒性、药物间相互作用或耐药性仅是管理HIV大流行所面临的部分挑战，更凸显了根治HIV-1的迫切性。
休克杀死疗法作为备受探索的治疗策略之一，旨在重新激活潜伏的HIV-1前病毒，进而消灭病毒生成细胞。
药理学上，HIV-1潜伏期的逆转已通过潜伏期逆转剂（LRA）广泛测试，这些逆转剂靶向与HIV-1潜伏期相关的细胞途径和蛋白质，以诱导前病毒转录。另一种休克策略则基于CRISPR/dCas9-VPR CRISPR的激活系统（CRISPRa），其具备HIV-1特异性潜伏期逆转的优势。近来有研究系统探究了dCas9-VPR CRISPRa系统，证实了其逆转HIV-1潜伏期的能力，并在HIV-1 5'长末端重复序列（LTR）启动子中确定了该系统的最佳引导RNA（gRNA）靶区gRNA-V。
对于HIV-1再激活后的杀伤阶段，需与cART联合使用以抑制再激活病毒的复制并预防新发感染事件。病毒细胞病变效应与免疫反应（如HIV-1特异性细胞溶解性T细胞（CTLs））虽能消除HIV-1潜伏期逆转的感染细胞，但已证实这些机制尚显不足。因此，额外的杀伤干预措施是一个空白却重要的领域，可采取治疗性疫苗、逆转免疫衰竭的药理学试剂、刺激细胞毒性或增强细胞死亡以及广泛中和抗体（bnAbs）等形式，而具有不同自杀基因的自杀基因疗法亦被探索，以靶向生产性与潜伏性HIV-1感染。
来自苏黎世大学的某研究小组之前建立了一种自杀基因载体，其中人类促细胞死亡蛋白截短的BID（tBid; BH3相互作用结构域死亡激动剂）的表达高度依赖于HIV-1辅助蛋白Tat和Rev，导致特异性、有效和快速地杀死有效的HIV 1感染细胞。为了递送庞大的DNA复合物，小组使用腺病毒载体，用三聚体接头重新靶向，有效抑制自然嗜性，并用于各种不同的受体和细胞类型。研究人员采用近期开发的CD3特异性重靶向适配器，该适配器被证明可以在各种环境下成功接种人类T细胞。由于CD4 + T细胞代表潜伏HIV-1库的主要部分，小组将这种CD3重靶向技术与dCas9-VPR CRISPR-VPR激活系统、最佳的HIV-1特异性gRNA-V和基于tBid的自杀基因策略相结合，将其作为本研究中的一种新型休克和杀伤方法。这种新型的靶向休克杀死一体化基因治疗方法，到底有没有可能在传染性病毒颗粒释放之前以特定方式安全有效地消除HIV-1感染的细胞？他们于Gene Therapy期刊展示了自己的成果。
doi:10.1038/s41434-023-00413-1
研究方法
研究对象：本试验共招募了六名患者，并将其分为两个剂量组：分别为0.9 x 1012和3 x 1012向量基因每公斤体重。其中，3 x 1012向量基因每公斤体重组被定义为高剂量组。所有患者均已接受过抗逆转录病毒治疗（cART）。
治疗方案：采用腺相关病毒9（AAV9）作为载体，将CRISPR Cas9多重系统导入患者体内。AAV9载体主要靶向含有潜伏HIV前病毒的CD4+ T细胞。
剂量分组：患者被分为两个剂量组，分别接受0.9 x 1012和3 x 1012向量基因每公斤体重的治疗。高剂量组接受较高浓度的基因治疗。
治疗中断：四名参与者在输注后12周中断抗逆转录病毒治疗，随访时间从10周至2年不等。
数据采集：在随访期间，定期采集血样以检测HIV RNA水平及其他相关生物标志物。同时，通过基因测序技术检测是否存在非目标DNA损伤。
安全性监测：对参与者进行不良事件的监测，特别是与治疗相关的低级别和严重不良事件。
研究结果
研究证明，这种新型的靶向休克杀死全酮基因治疗方法有可能以高度HIV-1和T细胞特异性的方式安全有效地消除HIV-1感染的细胞。详述如下。
结合CRISPRa、自杀基因tBid和重新靶向腺病毒递送的HIV-1休克和杀死-模型
研究测试了一种针对HIV-1的靶向电击杀死策略，该策略结合了dCas9-VPR CRISPR-VPR、HIV-1特异性gRNA-V和基于tBid的自杀载体（图1）。具体步骤如下：
gRNA-V靶向HIV-1转录起始位点，引导dCas9-VPR CRISPRa系统激活潜伏的HIV-1前病毒转录。
诱导HIV-1基因tat和rev表达，Tat蛋白与HIV-1启动子结合，驱动tVal表达；Rev蛋白与tVal mRNA中的Rev响应元件结合，将mRNA输出到细胞质。
tBid在细胞质中被翻译并转运到线粒体，诱导细胞色素c释放和线粒体外膜透化，最终导致细胞死亡。
该方法满足功能性自杀基因疗法的要求：依赖于HIV-1、快速有效、无免疫原性，并通过CD3重靶向腺病毒实现特异性递送。
图1 CD3重靶向腺病毒递送CRISPRa和tBid的HIV-1特异性靶向休克杀死方法的说明
腺病毒载体确保有效递送HIV-1特异性CRISPRa休克或HIV-1特异性tBid自杀杀伤策略。此外，用CD3重靶向接头包被Ads提供了高水平的T细胞特异性递送。休克中的dCas9-VPR CRISPR-VPR和HIV-1特异性gRNA-V Ad-CRISPRa-V通过靶向HIV-1 LTR启动子来激活潜伏前病毒的表达。早期基因tat和rev的表达导致杀死Ad-tBid传递的tBid自杀载体被激活。Tat蛋白与驱动tBid自杀基因表达的HIV-1 LTR启动子结合，Rev蛋白与tBid mRNA中的Rev响应元件（RRE）结合，从而能够将该mRNA输出到细胞质。tBid蛋白的表达在24小时内非常迅速地诱导细胞死亡，因为非常低的tBid蛋白量足以诱导细胞色素c（Cyt c）的释放并导致线粒体外膜透化（MOMP）。使用BioRender.com创建的人物（人物出版许可证HO 24 KAK 4FD）
CD3重靶向腺病毒载体递送的dCas9-VPR CRISPR-VPR逆转HIV-1潜伏期
研究团队选择了HIV-1特异性gRNA-V与dCas9-VPR CRISPR-VPR和CD3重靶向Ad载体组合，以验证CRISPRa系统对HIV-1前病毒的有效递送和激活。通过使用潜伏性HIV-1感染的细胞系J-Lat 6.3和J-Lat 10.6，这些细胞含有无法复制的近全长潜伏前病毒，研究证明了CRISPRa系统能够有效逆转HIV-1的潜伏状态，并通过流式细胞术检测GFP表达来评估CD3重靶向系统的激活效果（图2）。
研究团队选择了HIV-1特异性gRNA-V与dCas9-VPR CRISPR-VPR和CD3重靶向Ad载体组合，以验证CRISPRa的有效递送和HIV-1前病毒的激活。通过使用J-Lat 6.3和J-Lat 10.6细胞系，研究证明了Ad-CRISPRa-V能够高效逆转HIV-1潜伏期，而对照组Ad-CRISPRa-Con未激活前病毒。
在J-Lat 6.3细胞中，5.1%的细胞显示潜伏期逆转，而在J-Lat 10.6细胞中，67.4%的细胞显示更高的逆转率；CD3重靶向技术还显著提高了Ad载体的导入效率，在J-Lat 6.3和J-Lat 10.6细胞中分别达到28.5%和70.8%。总体而言，dCas9-VPR CRISPR-VPR和gRNA-V通过CD3重靶向Ads成功递送至T细胞，并有效激活了潜伏的HIV-1前病毒。
图2 dCas9-VPR CRISPR-VPR和CD3重靶向腺病毒递送的HIV-1 5 ' LTR特异性gRNA-V有效逆转HIV-1潜伏期
a 克隆到Ad载体中的CRISPRa构建体。CRISPRa休克构建体包含HIV-1特异性gRNA-V的表达盒，其靶向HIV-1 LTR。下游是dCas9-VPR CRISPR-VPR表达盒。CRISPRa对照Ad几乎相同，但它含有对照gRNS-Con而不是gRNA-V，gRNA-V是一种非靶向的随机核苷序列。
b、c 1 x 105 J-Lat 6.3或10.6细胞用4 x 103 VP（病毒颗粒）/重靶向接头包被的细胞（b）Ad-CRISPRa-V或Ad-CRISPRa-Con或（c）Ad-TdTomato。Ad包被通过将Ads与CD3重靶向接头（其摩尔过量为腺病毒纤维结50倍）在冰上预孵育1.5小时，然后添加到细胞中来进行。在导入后24小时，用TNF-a [10 ng/ml]激活细胞，作为单独的HIV-1激活对照。HIV-1潜伏期逆转和Ad传递效率在导入后48小时通过流式细胞术测量。
b CRISPRa在两种细胞系中显示了HIV-1潜伏期逆转效率，n = 3 + SD，作为HIV-1/GFP+细胞[%]标准化为各自的Ad导入效率。黑色条（未处理，TNF-a）显示未感染的细胞。
c显示了两种细胞系中的Ad导入效率（Ad+细胞）[%]，n = 2 ± SD。
显示的数据来自三个独立实验。*P < 0.05、**P < 0.002和 *P < 0.0002表示通过配对双尾t检验两个样本之间的统计学显著性。
潜伏期逆转后tBid快速杀死潜伏HIV-1感染的细胞
研究通过结合CD3重靶向的腺病毒递送与含有促细胞死亡蛋白tBid的自杀载体，成功杀死了HIV-1潜伏期逆转的感染细胞（图2）。
在J-Lat 10.6细胞系中，Ad-tBid显著减少了HIV-1/GFP阳性细胞（66.1 ± 11.8%），并增加了细胞死亡（3.6倍± 1.9）。对照组Ad-iRFP中，55.2 ± 5.0%的细胞呈HIV-1/GFP和iRFP双阳性。
比较Ad-iRFP与Ad-tBid处理后的细胞死亡率，发现43.7 ± 7.7%的HIV-1/GFP+细胞被消除。标准化杀伤作用为78.8 ± 6.6%，表明HIV-1激活后24小时内的杀伤功效约为80%（图3）。
图3 CD3重靶向腺病毒递送的tBid对重激活的HIV-1感染细胞的特异性快速杀伤
a描述了Ad载体中的自杀和控制基因盒。基因表达由HIV-1启动子控制，因此依赖于HIV-1 Tat。此外，基因表达依赖于HIV-1 Rev（RRE，Rev响应元件），HIV-1 gag的两个HIV-1抑制序列（IN）进一步增强了Rev依赖性。
b-d 1 x 105 J-Lat 10.6细胞用4 x 103 VP/细胞的重靶向适配器包被的Ad-iRFP或Ad-tBid进行导入。Ad包被通过将Ads与超过腺病毒纤维旋钮50倍摩尔过量的CD3重靶向接头在冰上预孵育1.5小时，然后将混合物添加到细胞中来进行。通过在导入后24小时添加TNF-a [10 ng/ml]来实现HIV-1潜伏期逆转。用死细胞僵尸染料染色后48小时的细胞，并通过流式细胞术测量HIV-1潜伏期逆转以及自杀载体转基因激活（iRFP或tBid）和细胞死亡。
b示例性流式细胞术图显示Ad-tBid和经TNF-a处理的Ad-tBid和Ad-iRFP转基因的细胞中HIV-1潜伏期逆转和细胞死亡。
c示出了HIV-1潜伏期逆转和细胞死亡，n = 3 ± SD，
d iRFP控制由HIV-1潜伏期逆转诱导的转基因激活，作为双阳性HIV-1/GFP+ iRFP+细胞[%]，n = 3 ± SD，以及Ad-iRFP加TNF-a样本的示例性流式细胞术图。黑色条（未处理，TNF-a）显示未感染的细胞。
数据来自三个独立实验。*P < 0.05和 **P < 0.002表示两个样本之间通过配对双尾t检验具有统计学意义。
实验中使用基于tBid的自杀杀伤策略，在HIV-1早期基因表达后直接诱导细胞死亡，因此不会出现双阳性HIV-1/GFP+死细胞。Ad-iRFP对照组显示TNF-α逆转HIV-1潜伏期时无明显细胞死亡，且单独的Ads导入不会增加毒性。仅Ad-tBid导入未显著增加细胞死亡，表明tBid无有害泄漏表达。TNF-α激活HIV-1与Ad-tBid导入的组合导致细胞死亡显著增加和HIV-1/GFP阳性细胞减少，且iRFP表达仅在HIV-1/GFP阳性细胞中观察到，表明自杀载体系统具有HIV-1特异性。
上述成果可以证明，当HIV-1被激活时，CD3重靶向Ads递送的tBid或iRFP转基因载体被排他性激活，并且这些细胞通过诱导细胞死亡而迅速消除。
HIV-1特异性休克和杀死组合消除HIV-1再激活细胞
在成功测试了靶向休克杀死方法的单个成分后，研究团队将靶向休克AdCRISPRa-V与靶向杀死Ad-tBid结合，并对J-Lat 10.6细胞进行了共导。结果显示，与使用Ad-iRFP的细胞相比，Ad-CRISPRa-V与Ad-tBid共导的细胞中，HIV-1/GFP阳性细胞群显著减少了57.7 ± 17.0%，绝对减少为34.8 ± 11.1%，标准化杀伤效应为74.1 ± 19.2%。这表明tVal表达通过Ad-CRISPRa-V诱导的HIV-1潜伏期逆转激活自杀载体，导致细胞死亡率增加2.4倍。与TNF-α和Ad-iRFP对照相比，TNF-α和Ad-tBid组合显示出更高的HIV-1阳性细胞群减少（69.8 ± 17.3%）和细胞死亡增加（2.4倍），标准化杀伤效果为89.3 ± 12.4%。在共转基因样本中，约24.7 ± 10.8%的HIV-1+/GFP+活细胞群未被杀死，代表仅用Ad-CRISPRa-V转化的细胞（图4）。
图4 CD3重靶向腺病毒传递的HIV-1特异性CRISPRa休克和tBid自杀基因杀死
用总共8 x 103 VP/细胞和1：1比例的两种不同重靶向Ad（Ad-tBid或Ad-iRFP和AdCRISPRa-V或Ad-CRISPRa-Con）同时导入1 x 105 J-Lat 10.6细胞。Ad包被通过将Ads与CD3重靶向接头预温育1.5小时，添加到细胞中。通过在导入后24小时添加肿瘤坏死因子a [10 ng/ml]，实现了CRISPRa-Con对照中的HIV-1潜伏期逆转。导入后48小时，用死细胞僵尸染料染色细胞并通过流式细胞术测量。
a示例性流式细胞术图显示Ad-CRISPRa-V和Ad-tBid或Ad-iRFP共转基因细胞中的HIV-1潜伏期逆转和细胞死亡。
b、c显示双重导入细胞中的HIV-1潜伏期逆转和细胞死亡，n = 3 ± SD。黑色条（未处理，TNFa）显示未感染的细胞。
数据来自三个独立实验。*P < 0.05、**P < 0.002和 ***P < 0.0002表示通过配对双尾t检验两个样本之间的统计学显著性。
这种电击杀死方法的独特性在于其HIV-1特异性成分，特别是基于tBid的杀死策略。HIV-1特异性gRNAV和dCas9-VPR CRISPR-VPR在HIV-1阳性细胞中诱导iRFP表达，且仅限于这些细胞。逆转HIV-1潜伏期后，iRFP表达同样被诱导。相比之下，Ad-CRISPRa-Con未激活HIV-1。两种成分的组合在HIV-1未感染的Jurkat细胞中未检测到LTR表达杀伤转基因，表明其安全性。
将dCas9-VPR CRISPR激活（CRISPRa）系统与gRNA-V、基于截短的Bid（tBid）的自杀基因策略以及CD3重靶向腺病毒（Ad）递送载体相融合，我们开创了一种一体化靶向休克杀死基因治疗方法，旨在实现对潜伏HIV-1感染细胞的特异性清除。通过CD3重靶向Ad载体，同时导入潜伏HIV-1感染的J-Lat 10.6细胞中的CRISPRa-V与Ad-tBid，我们观察到HIV-1感染细胞减少了57.7 ± 17.0%，细胞死亡率增加了2.4倍± 0.25倍。Ad-CRISPRa-V对潜伏性HIV-1前病毒的有效激活，其效力与激活对照肿瘤坏死因子-α相当。实验结果进一步证实，tBid展现出严格的HIV-1依赖性及非泄漏性杀伤作用。此外，CD3重靶向技术在HIV-1潜伏感染细胞系中高达70.8 ± 0.4%的高转换效率，为成功实施休克杀死策略奠定了坚实基础。
讨 论
电击杀灭法作为HIV-1治疗领域中研究最为深入且临床应用最为先进的手段之一，其核心研究多聚焦于休克机制，而与“杀死”策略的结合研究则相对匮乏。在此，研究组巧妙地将CRISPR激活（CRISPRa）休克策略与基于tBid的自杀基因杀死策略相融合，成功验证了其在J-Lat HIV-1潜伏模型中对潜伏性HIV-1感染细胞的有效清除。此外，通过CD3重靶向腺病毒载体的实施，研究组进一步将此方法升华，打造出一种兼具高度HIV-1及T细胞特异性的新型靶向休克杀死疗法。
作为逆转HIV-1潜伏期的新锐策略，相较于多数体外LRA，CRISPRa系统的再激活效力更为卓越。研究组前期研究已证实，dCas9-VPR CRISPR-VPR系统与gRNA-V在多种潜伏感染细胞系模型中展现出卓越的HIV-1激活能力，并能有效重新激活复制能力的前病毒。本研究涉及的两种潜伏性HIV-1感染细胞系均携带近乎完整但无复制能力的前病毒，主要处于转录沉默状态。相较于J-Lat 10.6细胞，J-Lat 6.3细胞中的前病毒抑制程度更为显著。与前期研究相呼应，研究组通过创新策略在J-Lat 10.6与J-Lat 6.3细胞中实现了强烈的HIV-1再激活，其效力可媲美肿瘤坏死因子-α，后者在这些细胞中是极为强劲的HIV-1激活剂。
本研究将dCas9-VPR CRISPR-VPR与gRNA-V系统与基于tBid的自杀基因策略相融合。tBid，作为促细胞凋亡Bax-2家族的一员，已被广泛研究并应用于癌症治疗，亦与腺病毒载体结合。在潜伏性HIV-1感染背景下，抗细胞死亡蛋白（如Bcl-2）表达上调，而促细胞死亡蛋白则被抑制，从而有利于潜伏感染细胞的存活。因此，通过促细胞死亡化合物（如Bcl-2受体阻滞剂）调控细胞存活或死亡途径的杀伤方法颇具吸引力。前期研究已通过细胞死亡标志物（如膜联蛋白-V、半透明蛋白酶3、8和9）的表达检测或细胞活力分析，证实了tBid对细胞死亡的诱导及其动力学。当以亚纳摩尔浓度应用时，tBid的细胞杀伤作用极为迅速，仅需50-70秒。tBid表达的多氧霉素依赖性诱导显示，24小时内可杀死高达98%的细胞。
CRISPRa系统临床应用的主要障碍是有效且安全的体内输送。腺病毒和慢病毒载体都适合基于spCas9的疗法，尤其是CRISPRa系统，其转基因大小范围为~5.2至7.5 KB，具体取决于系统。Ad载体提供了转基因的非整合递送，并具有更高的安全性；然而，迄今为止，非靶向未修饰Ad的低导效率（尤其是T细胞）是其使用的主要限制。
研究组团队设计了一种基于HIV-1 LTR、HIV-1 Tat及Rev依赖性tBid表达盒，并验证了其对HIV-1感染细胞的有效针对性。在Tat与Rev两种病毒蛋白的协同作用下，细胞在24小时内被高效且迅速地诱导死亡。在此，研究组进一步证实了在HIV-1潜伏期逆转后，tBid在潜伏感染的J-Lat 10.6细胞中的杀伤作用，并揭示了当基于tBid的自杀基因杀伤策略与CRISPRa休克策略相结合时，对HIV-1感染细胞的清除同样高效。
本研究阐述的新型靶向休克杀死HIV-1基因治疗策略，有望在传染性病毒颗粒释放前，以高度特异性的方式安全有效地清除HIV-1感染细胞。特定靶向T细胞或HIV-1感染细胞的治疗目标，已通过多种途径探索，如利用CD7特异性链可变片段抗体、CD4特异性DARPins或HIV-1 gp140等。通过应用CD3重靶向技术，将治疗递送至HIV-1感染的主要靶点T细胞，不仅更为高效，且更具特异性，进一步接近了理想的基因治疗递送载体，该载体融合了大容量、高效传递、高安全性和受体特异性传递等优势。此外，先前研究表明，Ad适配器重靶向技术可应用于递送容量达35 KB的辅助依赖性Ad，并可与Capsule覆盖蛋白涂层结合。未来体内研究计划将辅助依赖性广告与免疫屏蔽结合，以实现双重策略并防止免疫识别。
此方法具备以下高度灵活与可定制特点：
(1) 多种HIV-1特异性gRNA可覆盖HIV-1前病毒多样性，精准靶向患者体内所有前病毒。
(2) 两种休克杀死成分可在无肠道腺病毒载体中递送，确保两种效应物在同一细胞内发挥作用。
(3) 细胞和组织特异性启动子可进一步限定Ad货物的表达范围。
(4) Ad免疫屏蔽可通过Capsule覆盖屏蔽实现，避免体内免疫识别。
(5) 可应用不同受体靶向模块，如CD4特异性模块，甚至组合应用，以进一步增强对HIV-1感染细胞的特异性，并扩展至其他有助于潜伏HIV-1库的细胞类型，如单核细胞/巨噬细胞。
根除HIV-1的终极目标，以及通过靶向休克杀死方法对HIV-1的特异性靶向与清除，需借助靶向潜伏HIV-1库生物标志物的适配器，因其可针对任何表面蛋白进行定制。例如，细胞表面蛋白CD32a被提议作为HIV-1潜伏期标志物；然而，其他研究结果存在矛盾，故在静息CD4+ T细胞中寻找可靠且特定的HIV潜伏期生物标志物仍是当前研究重点。
参考文献：Klinnert S, Schenkel CD, Freitag PC, Günthard HF, Plückthun A, Metzner KJ. Targeted shock-and-kill HIV-1 gene therapy approach combining CRISPR activation, suicide gene tBid and retargeted adenovirus delivery. Gene Ther. 2024;31(3-4):74-84. doi:10.1038/s41434-023-00413-1