编者按：自噬在免疫和炎症中的作用的大多数研究都集中在外周组织巨噬细胞或其他类型的细胞上，而对自噬在小胶质细胞中的作用和调节机制知之甚少。本期“结核之窗”栏目中，卢水华教授团队将分享一项发表于《自噬》（Autophagy）的研究，探讨了在小胶质细胞中TLR4（toll样受体4）通过抑制FOXO3抑制自噬，并损害小胶质细胞的吞噬能力。针对小胶质细胞自噬的独特调控机制，该研究可为调节脑疾病中小胶质细胞的功能提供潜在治疗靶点。
研究简介
研究背景
自噬在免疫细胞中被炎症刺激激活，巨噬细胞研究最深，其自噬活性经MAP1LC3B/LAP促进吞噬和降解，TLR4、TLR7激活可诱导自噬，多种蛋白调节脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞自噬，LPS也能诱导其他细胞自噬。小胶质细胞是中枢神经系统关键免疫细胞，对大脑发育和体内平衡重要，能释放介质、吞噬降解微生物及细胞碎片等，也能处理脑源性物质，但病理损伤时其活化会分泌有害炎症介质，是神经退行性疾病组织损伤的致病途径之一。小胶质细胞源于胚胎造血髓系细胞，与巨噬细胞功能和激活表型相似，但两者免疫信号和自噬的相互作用未明。本研究探究TLR信号对小胶质细胞自噬的影响，发现LPS对小胶质细胞和巨噬细胞自噬作用相反，LPS显著抑制小胶质细胞自噬，通过抑制FOXO3实现，还能削弱其吞噬能力。这揭示了活化的小胶质细胞和巨噬细胞自噬的差异调节，提出I类PI3K-FOXO3通路作为脑部疾病潜在治疗靶点，为脑部疾病治疗提供了新思路，后续研究可深入探究该通路的具体机制及应用前景，有望为相关疾病的治疗带来突破。
研究方法与结果
1. 脂多糖抑制小胶质细胞的自噬
巨噬细胞中TLR配体可诱导自噬，为探究其对小胶质细胞自噬的影响，用TLR1/2、TLR3、TLR4和TLR7的特异性配体处理原代小胶质细胞，以TNF释放作为炎症反应指标，用检测MAP1LC3B的抗体进行蛋白质印迹评估自噬。结果显示，4种配体都使MAP1LC3B-II水平大幅降低，经BafA1测试，确定此降低是自噬通量减少所致，而非加速自噬引起。研究选择LPS（TLR4配体）深入探讨分子机制，发现LPS处理后小胶质细胞系BV-2中自噬受抑制，而在骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）及小鼠巨噬细胞系Raw264.7中，LPS增加MAP1LC3B-II水平和自噬通量，与之前报道一致，且BMDM中MAP1LC3B-II水平定量方式与原代小胶质细胞相同。ZFYVE1是早期自噬标志物，转染实验显示，LPS处理增加Raw264.7细胞中ZFYVE1点形成，但小胶质细胞中无此现象，且LPS处理使BV-2细胞中MAP1LC3B点数量减少及BafA1诱导的积累减少，蛋白质印迹分析表明LPS对小胶质细胞自噬的抑制从6小时开始显著，持续至少24小时，这说明LPS抑制小胶质细胞自噬，与在巨噬细胞中的作用相反。此外，通过在HBSS中孵育细胞诱导小胶质细胞自噬作为阳性对照，结果显示自噬通量增加，表明自噬会响应小胶质细胞营养饥饿正常诱导，却被TLR触发的免疫信号传导特异性抑制。
综上所述，通过多种实验探究TLR配体对小胶质细胞自噬的影响，发现LPS等配体可抑制小胶质细胞自噬，与在巨噬细胞中诱导自噬的作用相反，且自噬可响应小胶质细胞营养饥饿正常诱导，但会被TLR触发的免疫信号传导特异性抑制。
△LPS抑制小胶质细胞自噬
2. LPS下调小胶质细胞中Atg基因的表达
为探究LPS对Atg基因表达的影响，通过qRT-PCR分析发现，LPS处理小胶质细胞24小时后，显著抑制了包括Map1lc3b等多个Atg基因的表达，结合MAP1LC3B周转及自噬体数量变化，可知自噬抑制具有持续性。对比LPS处理后的小胶质细胞和巨噬细胞，BMDM中无Atg基因下调，甚至部分基因显著上调。为进一步验证，对LPS注射小鼠的小胶质细胞和腹膜巨噬细胞急性分离，两者均高表达促炎细胞因子且Tspo转录水平升高，说明均被有效激活，但小胶质细胞Atg基因表达降低，巨噬细胞则上调。
总之，LPS处理后会抑制小胶质细胞中Atg基因表达，而在巨噬细胞中相关Atg基因或无下调或有上调，进一步证实了LPS对小胶质细胞和巨噬细胞自噬的影响相反。
△LPS下调原代小胶质细胞中Atg基因的表达
3. LPS对自噬的抑制是TLR4依赖性的
为了验证LPS对小胶质细胞中自噬的抑制是否依赖于TLR4，本研究在从 小鼠分离的小胶质细胞中添加了LPS。按照已发表的方案，通过PCR确认基因tlr4敲除情况。tlr4敲除的小胶质细胞中的自噬通量水平不受LPS的显着影响。此外，LPS处理后， 小胶质细胞中的Atg基因的表达都没有明显变化。
总之，LPS诱导的自噬抑制是通过关键的上游调节因子TLR4进行的。
△LPS对自噬的抑制依赖于TLR4
4. 磷脂酰肌醇测量
PtdIns磷酸化产物PtdIns3P对自噬诱导关键，其与效应蛋白结合介导Omegasome形成，推测PtdIns水平变化是LPS刺激下小胶质细胞自噬抑制的原因。对LPS注射小鼠小胶质细胞基因表达谱公开数据的通路分析显示，参与PtdIns前体生成及相关磷脂合成的基因下调，生物信息学数据表明LPS抑制自噬可能因PtdIns及其衍生磷脂水平降低致自噬体生物发生减少。为验证该预测，用Q-TOF LC/MS测LPS处理16小时后小胶质细胞和BMDM中PtdIns细胞内量，小胶质细胞中PtdIns 38：4含量显著降低，BMDM中显著增加，利血平作内标确保准确性。又因PtdIns是PtdIns3P底物，用ELISA测脂质，发现LPS处理12小时后BV-2细胞中PtdIns3P量减少25%，Raw264.7细胞无变化。
总之，即LPS减少小胶质细胞中PtdIns和PtdIns3P合成，不影响巨噬细胞。解释小胶质细胞和巨噬细胞之间对LPS的自噬反应差异的一种可能机制可能是PtdIns和PtdIns3P生物合成调节的差异。
△对LPS激活的小胶质细胞的RNA测序数据进行生物信息学分析
△LPS可减少小胶质细胞中PtdIns和PtdIns3P的合成
5. LPS通过PI3K-AKT1信号通路抑制自噬
为明确LPS处理后下调自噬基因的信号通路，聚焦于MTOR、MAPK1/3和PI3K-AKT1，这些激酶易被LPS激活且能抑制自噬。LPS使MAPK1/3、MTOR、RPS6KB1及AKT1相关位点磷酸化增加。PD98059抑制MAPK1/3却不影响LPS所致自噬抑制，雷帕霉素和Torin-1抑制MTOR也未逆转该抑制，不过能使RPS6KB1去磷酸化。而PI3K抑制剂LY294002和Wort抑制PtdIns3K活性，抵消了LPS处理细胞中MAP1LC3B周转率的减少，LY使LPS处理的小胶质细胞MAP1LC3B-II水平恢复至对照组高度，还升高了基础自噬通量，且阻断了AKT1的磷酸化，证实其对PI3K的抑制作用。
总的来说，这些数据表明PI3K-AKT1信号通路在LPS诱导的小胶质细胞自噬抑制中起关键作用。
△LPS通过PI3K-AKT1信号通路抑制原代小胶质细胞的自噬
6. LY294002通过阻止LPS诱导的FOXO3磷酸化来挽救小胶质细胞自噬
鉴于PI3K-AKT1通路在小胶质细胞自噬中的关键作用，推测其下游靶标FOXO3可能介导TLR4-PI3K-AKT1的抑制效果。AKT1对FOXO3磷酸化可使其从细胞核输出并降解，从而抑制其转录活性，而未磷酸化的FOXO3能激活自噬相关基因表达。实验发现，LPS以时间依赖方式增加FOXO3在S253位点的磷酸化，LY处理则降低该磷酸化。在小胶质细胞中，对照时FOXO3主要在胞质溶胶，LPS处理使其从细胞核强烈输出，LY抑制PI3K后恢复了FOXO3核保留且Atg基因表达增加。但这不足以解释小胶质细胞和巨噬细胞自噬差异，经检测发现，BMDM中基础状态下细胞核内FOXO3比例高于小胶质细胞，LPS处理使BMDM核内FOXO3定位增加而非减少，且LPS诱导的BMDM中FOXO3和AKT1 T308磷酸化呈瞬时增加，与小胶质细胞的持续磷酸化不同。为确定FOXO3在小胶质细胞自噬中的作用，表达FOXO3的组成型活性形式（FOXO3-CA-GFP），其在BV-2细胞中呈强核定位并使MAP1LC3B点数量增加，BafA1处理后自噬通量恢复。
总之，这些数据表明TLR4触发的PI3K-AKT1激活及随后的FOXO3抑制，是炎症信号抑制小胶质细胞自噬的关键效应步骤，小胶质细胞和巨噬细胞在FOXO3分布和磷酸化时程上的差异，体现了FOXO3在小胶质细胞自噬和免疫界面的深度整合。
△PI3K-AKT1磷酸化FOXO3可抑制原代小胶质细胞的自噬
△组成型活性FOXO3（FOXO3-CA）的过表达可增加基础条件下和LPS处理后MAP1LC3B 点数量
7. LPS通过小胶质细胞中的PI3K-AKT1信号通路减少MAP1LC3B相关吞噬作用和Aβ降解
小胶质细胞是脑内专业吞噬细胞，为探究自噬抑制对其功能的生理意义，先分析LPS处理的小胶质细胞吞噬能力。巨噬细胞中TLR信号激活与吞噬、自噬存在交集，但小胶质细胞在此方面尚无研究。结果显示，LPS显著抑制小胶质细胞自噬，进入LPS处理的原代小胶质细胞中MAP1LC3B阳性自噬体的酵母聚糖颗粒减少，LY处理可上调其形成；BV-2细胞中Atg7敲低影响MAP1LC3B相关吞噬体形成，说明小胶质细胞LAP需经典自噬。为研究LPS抑制自噬的病理意义，用PLA评估自噬体与纤维β淀粉样蛋白（Aβ）相关性，LPS降低PLA信号，LY可恢复，且细胞中Aβ降解情况与之对应，更多Aβ保留在LPS处理细胞，LY+LPS处理细胞降解Aβ与对照细胞一样有效。
总之，表明LPS诱导的PI3K-AKT1信号下调小胶质细胞自噬相关吞噬能力和和Aβ降解，PI3K抑制可逆转此下调。
△LPS通过PI3K-AKT1信号通路抑制小胶质细胞中与MAP1LC3B相关的吞噬作用和Aβ降解
研究结论
本研究表明，与巨噬细胞不同，LPS通过TLR4抑制小胶质细胞自噬，下调Atg基因表达，减少自噬通量，且影响磷脂酰肌醇代谢。其机制涉及PI3K-AKT1-FOXO3通路，FOXO3在其中起关键作用。此外，LPS还损害小胶质细胞的吞噬能力，包括MAP1LC3B相关吞噬和Aβ降解，而PI3K抑制可恢复部分功能。
研究意义
这些发现揭示了小胶质细胞自噬的独特调控机制，提示PI3K-FOXO3通路可能是调节脑部疾病中小胶质细胞功能的潜在治疗靶点，为深入理解神经炎症和神经退行性疾病的发病机制提供了重要依据，并为包括AD在内的神经退行性发病机制提供新的见解，指出该通路是调节脑疾病中小胶质细胞功能的潜在治疗靶点。
研究点评
自噬是一种进化上保守的细胞内降解过程，通过形成自噬体，随后与溶酶体融合，从而导致自噬溶酶体的形成。除了自噬的传统稳态和适应性功能外，最近的研究表明，自噬还通过调节细胞因子的产生和释放、炎症小体的激活、抗原呈递以及清除入侵病原体等在免疫中发挥关键作用。越来越多的证据表明，自噬对于最佳的免疫功能是必要的。例如，自噬可以清除入侵的病原体，如分枝杆菌或有毒物质。以前关于自噬在免疫和炎症中的作用的大多数研究都集中在外周组织巨噬细胞或其他类型的细胞上，而对自噬在小胶质细胞中的作用和调节机制知之甚少。目前关于小胶质细胞中自噬的少数可用研究显示结果不一致。
自噬抑制机制因细胞类型和状态而异。TLR触发的自噬信号级联与营养应激诱导的相似，但饥饿抑制MTOR（自噬负调节因子），TLR4激活后，MTOR在小胶质细胞和巨噬细胞中被强烈激活，这体现了与饥饿诱导不同的复杂信号通路。还有MTOR非依赖性自噬抑制的情况，如骨骼肌中雷帕霉素不诱导自噬，FOXO3可独立于MTOR复合物1活性激活自噬。尽管MTOR的激活可能部分影响了自噬水平，但在LPS处理的小胶质细胞中，LPS诱导的自噬抑制主要与PI3K-AKT1信号传导有关。或许呈现不完全自噬的情况。
转录调控对自噬调节意义重大，TFEB是Atg基因表达的关键调节因子，MTOR和MAPK1/3作为负向调节TFEB的激酶，能磷酸化TFEB并使其留于溶酶体，进而抑制自噬，去磷酸化后TFEB移位至细胞核激活自噬基因诱导自噬。在活化的小胶质细胞中，自噬更多依赖PI3K-AKT1-FOXO3信号传导而非MTOR-MAPK1/3-TFEB，因为前者在这类细胞中难以有效诱导自噬。尽管PI3K抑制使LPS处理的小胶质细胞中Atg基因表达水平恢复，但部分受检Atg基因启动子区域并无已知FOXO3结合序列，所以这些基因是否存在尚未发现的FOXO3结合序列，或者其他转录因子是否也受小胶质细胞中LPS的影响，有待进一步探究。
尽管缺乏关于小胶质细胞自噬调节机制的知识，但自噬在小胶质细胞功能中的重要性正在得到认可。例如，缺乏小胶质细胞Atg7的小鼠表现出各种神经缺陷，包括突触修剪受阻、社交行为缺陷、清除受损以及炎症小体激活增强。这些证据表明，小胶质细胞自噬的适当调节对于正常的脑功能至关重要，并证明了小胶质细胞自噬在脑功能和病理学中的生理重要性。
TLR信号传导对自噬的抑制作用，为揭示受损小胶质细胞功能如何致使脑稳态失衡，进而引发神经退行性疾病的发病机制，提供了重要线索。在诸如阿尔茨海默病（AD）等神经退行性疾病患者的大脑中，明显可见小胶质细胞吞噬和降解的能力出现下降，然而，AD中小胶质细胞吞噬活性受损的具体复杂机制，至今尚未完全明确。以往观点认为，AD患者体内过量产生的Aβ首先使自噬-溶酶体途径不堪重负，继而引发自噬系统功能障碍，最终导致小胶质细胞出现“燃尽”状态。但本研究的数据显示，在神经炎症起始阶段被激活的小胶质细胞中，自噬受到抑制以及吞噬降解能力下调的情况就已十分显著。根据观察，有研究表明，促炎细胞因子能够减弱Aβ诱导的吞噬作用，但Aβ并不会引发明显的小胶质细胞活化，也不会降低其吞噬能力。另一项饶有趣味的研究指出，人类AD患者的小胶质细胞中，BECN1水平降低，且Aβ吞噬降解效率低下。尽管该研究未对自噬水平进行检测，但从理论上推测，AD患者来源的小胶质细胞很可能存在自噬抑制的情况。目前，AD小胶质细胞中BECN1 水平降低的原因尚不清晰，不过，BECN1缺乏或许并非仅仅是淀粉样蛋白积累这一单一因素所致，可能还存在其他方面的原因，有待进一步深入探究。
虽然本研究观察到LPS诱导小胶质细胞自噬损伤、降解能力降低，这能揭示神经炎症对神经退行性变的贡献，PI3K-FOXO3通路是潜在治疗靶点。但因小胶质细胞和巨噬细胞对相同刺激反应相反，我们对退化大脑的神经炎症环境中其自噬调节机制还有很多需要了解的。
卢水华 教授
教授，主任医师，二级教授，博士生导师
国家感染性疾病临床医学研究中心副主任，深圳市第三人民医院肺病医学部主任
担任：中华医学会结核病分会候任主委，世界卫生组织全球儿童和青少年结核病工作组成员，中国防痨协会学校与儿童结核病分会主委，上海市医学会结核病学分会荣誉主委，广东省医学会结核病学分会主委，第二届国家名医获得者，上海市十佳医师，国家十三五传染病重大专项负责人，国家自然基金重大课题负责人，国家卫健委流感医疗救治专家组成员，国家自然科学基金评审专家，国家药监局新药评审专家，国家药监局医疗器械评审专家，中华医学会医疗鉴定专家，多杂志副主编、编委及审稿专家
长期致力于TB的发病机制、疫苗与诊断技术开发、流行病学及新药临床试验等领域的研究：深入开展大规模人群队列研究，明确我国大学生人群Mtb感染率和BCG保护效率；构建和组织实施“结核感染免疫诊断分层解决方案”，牵头完成我国40年来首个结核I类新药（EC）的临床试验及上市；积极探索TB防控“关口前移”新策略，建立和推广结核潜伏感染早期筛查和精准干预体系；针对当前TB防治瓶颈问题，提出的“一体化综合防控策略”为“End TB”贡献了中国原创理论和技术产品体系。主持包括国家“十三五”传染病重大专项、重大新药创制项目、国家自然基金重大课题在内的国家、省部和市级科研项目11项，合计研究经费超7260万元。在NEJM、Lancet、PNAS等顶级期刊发表学术论文73篇，组织撰写指南与专家共识3篇，主编专著1部。相关成果获“中国防痨协会科学技术奖”一等奖和“上海医学科技奖”三等奖，多次被WHO指南引用
张慧敏
华中科技大学神经生物学博士
主要研究领域：脑神经环路研究，神经疾病药物开发，抗肿瘤药物药效研究等。发表学术论文2篇，其中一作1篇。参与多项国家级重点研发及自然科学基金项目。