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癌细胞的扩散和转移是癌症致死性和治疗难度增加的重要原因之一。癌细胞的扩散与肿瘤微环境密切相关。
胰腺导管腺癌（PDAC）预后不良的主要原因就是肝脏的早期远处转移。大多数PDAC患者在确诊时已经有肝转移，或手术后出现肝复发。有研究表明，原发肿瘤和转移瘤的微环境不同，肝脏微环境的非实质细胞群（如肝窦内皮细胞和免疫细胞）在肿瘤转移中可能具有特殊作用。
血小板在癌症进展和转移中发挥作用，对患者预后产生不利影响。血小板平均体积升高已经被证明与同步肝转移PDAC患者生存结果较差有关。研究人员推测，活化血小板的脱颗粒分子可能是肝脏中PDAC生长的主要驱动因素。
因此，为了明确血小板在PDAC肝转移微环境中的作用，来自上海交通大学医学院附属仁济医院的杨小妹、李冬雪、张雪莉团队建立了转移性微环境标记系统，探讨了PDAC肝转移患者体内肿瘤细胞与血小板之间的相互作用。
结果显示，PDAC患者肝转移微环境内存在活化血小板，血小板耗竭可以抑制小鼠肝转移性肿瘤的生长。肝转移微环境中，肿瘤细胞表面EPHB1和血小板表面EFNB1相互作用，激活AKT信号通路，促进血小板释放血清素（5-HT），从而促进肿瘤生长。
研究发表在《癌症通讯》杂志上。
为了研究PDAC肝转移微环境中涉及的细胞组分，研究人员设计了mCherry微环境标记系统，通过转移性癌细胞释放的细胞穿透性荧光蛋白标记周围的宿主细胞，从而识别和观察微环境。
研究人员通过基因工程构建了小鼠PDAC肝转移模型，利用mCherry发现，在肝脏微环境中，标记的宿主细胞（GFP−mCherry+）主要包括CD45+免疫细胞和CD41+血小板。其中血小板的比例最高，活化血小板的数量远多于非活化血小板。
mCherry微环境标记系统示意图，在PDAC肝转移微环境中识别到活化血小板
KPC1199细胞荧光图像，mCherry（红色），GFP（绿色）
来自人类患者的数据也显示，与原发性肿瘤相比，肝转移瘤中血小板活化和聚集发现了显著变化，血小板活化相关基因显著富集，肝脏微环境内可以观察到大量组织浸润血小板积聚。这就证明，小鼠和人类PDAC样本肝转移瘤中都存在大量活化血小板。
为了确定微环境中血小板功能，研究人员用抗CD41抗体特异性消耗了模型小鼠的血小板，肝转移瘤的肿瘤负荷显著降低；同时，直接接触和非接触共培养实验表明，血小板与肿瘤细胞直接接触时，活化血小板脱颗粒分子（PF4、5-HT和HexA等）水平更高，肿瘤细胞增殖更为显著。也就是说，血小板主要依赖于与肿瘤细胞发生接触依赖性相互作用促进肿瘤细胞生长。
血小板和肿瘤细胞直接接触共培养促进肿瘤细胞生长
为了进一步分析促进肿瘤细胞生长的关键分子，研究人员分析了25例肝转移性PDAC患者肝转移瘤的RNA-seq数据，发现轴突导向分子EPH/Ephrin家族的EPHB1表达显著升高，EPHB1的高水平表达与患者总生存时间较短有关。
进一步在模型小鼠中过表达Ephb1，可以使肿瘤细胞与血小板的粘附能力显著增强，并且促进血小板脱颗粒分子释放，5-HT水平更是显著升高。体内水平上，Ephb1过表达显著增加了肝脏转移性结节的大小和肿瘤负担，肝转移组织中与血小板聚集、血小板活化等功能相关的通路显著上调，活化血小板增加。而血小板耗竭后，Ephb1过表达引起的肝脏转移性肿瘤负担显著减轻，证明Ephb1对肝转移微环境中肿瘤生长的促进作用依赖于血小板活化。
EPHB1通过激活血小板促进肝转移微环境中PDAC生长
血小板表面唯一已知的EPHB1配体为EFNB1，其相互作用可以启动EPHB1的正向信号传导和EFNB1的反向信号传导，促进肿瘤-血小板依赖性生长。研究人员假设，肿瘤细胞和血小板之间的接触依赖性信号是由EPHB1/EFNB1介导的。
使用拮抗剂阻断EPHB1/EFNB1相互作用，可以在过表达Ephb1的PDAC肿瘤细胞中降低血小板粘附。使用EPHB1-Fc模拟EPHB1活性与EFNB1结合，可以成功诱导血小板活化，同时，研究人员还发现了PI3K/AKT通路的激活。抑制PI3K/AKT信号可以显著抑制血小板活化，说明EPHB1/EFNB1信号传导依赖于PI3K/AKT通路的激活。
5-HT促进肝转移微环境内中转移性PDAC生长
找到完整的通路，研究人员终于腾出手来看看肝转移微环境中血小板大量释放的5-HT是怎么个事儿。
敲除肝转移性PDAC模型小鼠的5-HT合成相关基因（Tph1−/−），将来自野生型小鼠或Tph1−/−小鼠的血小板与肿瘤细胞共培养，可以观察到Tph1−/−肿瘤细胞活力显著低于对照组。在小鼠体内，Ephb1过表达引起的肝转移性肿瘤负荷增加在Tph1−/−小鼠中明显减弱，血小板耗竭进一步抑制了肝转移（尽管程度不大），小鼠总生存时间延长。
体内和体外数据均表明，EPHB1对肝转移微环境中转移性PDAC生长的促进作用是血小板依赖性的，并且主要依赖于5-HT。
总的来说，研究利用mCherry微环境标记系统，在PDAC患者的肝转移微环境内鉴定了血小板功能，并一步揭示了血小板通过EPHB1-EFNB1与肿瘤细胞的直接相互作用，凸显了以EPHB1或血小板为靶点作为PDAC肝转移治疗潜在干预措施的意义。
参考文献：
本文作者丨王雪宁