【导读】尽管治疗策略有了进步，但肝细胞癌（HCC）的长期生存率仍然不乐观。因此，了解肝细胞癌的机制可能为患者带来显著的好处。
11月30日，南方医科大学付顺军教授研究团队在期刊《Cell Death&Disease》上发表了研究论文，题为“A N7-methylguanosine modified circular RNA, circIPP2A2, promotes malignant behaviors in hepatocellular carcinoma by serving as a scaffold in modulating the Hornerin/PI3K/AKT/GSK3β axis”，本研究中，研究结果表明，circIPP2A2下调在体外和体内显著抑制HCC的肿瘤发生和进展。具体来说，本研究发现，在N7-甲基鸟苷酸修饰的调控下，circIPP2A2作为调节Hornerin/PI3K/AKT/GSK3β轴的分子支架，促进了HCC的恶性行为。靶向circIPP2A2可能是治疗HCC患者的一种有前途的策略。
https://www.nature.com/articles/s41419-024-07248-7
背景信息
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肝细胞癌（HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一。2020年全球约有91万新发病例和83万死亡病例。其中一半发生在中国，因为乙肝病毒感染的高发率。尽管治疗策略得到了发展，新型治疗靶点也出现了，但由于缺乏早期诊断和预后监测的标记物，HCC患者的预后仍然不乐观。因此，发现新的生物标志物并了解HCC的调控机制对患者具有重要的临床益处。
m7G是人类最常见的RNA修饰之一，由METTL1-WDR4复合体调控。METTL1是负责m7G形成的催化酶，而WDR4在稳定m7G复合物中起关键作用。近年来的研究表明，m7G修饰与人类生物学过程和肿瘤的发生发展相关。例如，mettl1介导的m7G修饰通过破坏初级miRNA的二级结构来增强let-7 miRNA的加工，这可能是RNA修饰调控miRNA结构的新见解。在肝癌中，研究人员发现mettl1介导的m7G tRNA修饰通过促进EGFR翻译而促进肝内胆管癌进展。这些结果提示METTL1介导的m7G修饰与疾病的发生和进展存在相关性。然而，m7g修饰的circRNAs的作用机制仍有待揭示。
关于circIPP2A2表达的新见解
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研究人员利用慢病毒载体建立了两个circIPP2A2稳定敲低的肝癌细胞株（hep3b - shcircipp2a2# 1、#2、#3和hcclm3 - shcircipp2a2# 1、#2、#3），然后研究人员选择#2和#3稳定转染细胞系进行后续研究。CCK-8实验结果显示，敲低circIPP2A2表达显著抑制肝癌细胞的增殖能力。克隆形成实验结果表明，circIPP2A2表达下调具有抑制肝癌细胞克隆形成能力的潜能。研究人员通过划痕实验和迁移实验检测了circIPP2A2对肿瘤转移和侵袭能力的影响。划痕实验结果表明，circIPP2A2表达下调抑制了肝癌细胞的迁移。迁移实验结果表明，敲低circIPP2A2表达可抑制肝癌细胞的侵袭和迁移。circIPP2A2表达下调可抑制肝癌细胞的恶性生物学行为。
下调circIPP2A2表达可抑制肝癌的体内外恶性生物学行为
随后，研究人员采用小鼠模型研究体内抑制circIPP2A2表达引起的肿瘤抑制效果。研究结果表明，沉默circIPP2A2表达可抑制肝癌肺转移。HE染色证实肺转移淋巴结。研究人员通过皮下注射Hep3B细胞株建立细胞源性异种移植（CDX）模型。结果显示，circIPP2A2下调抑制了肿瘤生长，导致了更低的肿瘤负荷。综上所述，这些结果证明了circIPP2A2的下调在体外和体内都抑制了肝癌的恶性行为。
促进HCC发生或进展的新机制
03
为了鉴定参与circIPP2A2 m7G修饰的蛋白及其与RNA分子的相互作用，研究人员使用靶向METTL1和WDR4的抗体进行RIP实验。尤其是，研究人员使用qPCR鉴定了METTL1与circIPP2A2的序列具有亲和力，而不是WDR4。随后的蛋白质印迹法和qPCR检测显示，在稳定敲低circIPP2A2的细胞株中，METTL1的mRNA和蛋白水平没有显著变化。而且，通过使用sirna沉默METTL1的表达，qPCR结果表明，METTL1的下调能够抑制circIPP2A2的表达，但线性IPP2A2的表达保持不变。因此，以上结果确定了METTL1是circIPP2A2的上游调控因子。
考虑到m7G修饰在癌症发生发展中的重要作用，研究人员利用在线生物信息学工具iRNA-m7G数据库预测circIPP2A2中潜在的m7G修饰位点。根据iRNA-m7G数据库，circIPP2A2的大部分m7G位点位于+ 545-683区域。研究人员采用抗m7G抗体m7G- merip实验验证circIPP2A2的m7G修饰位点。m7G- merip - qpcr结果显示，抗m7G可捕获circIPP2A2的潜在m7G修饰区域，沉默METTL1表达降低了circIPP2A2的m7G富集。先前的研究表明，m7G修饰具有增强mRNA稳定性和促进翻译的潜力。根据这些发现，研究人员对circIPP2A2的稳定性进行了检验。研究表明m7G修饰增强了circIPP2A2的稳定性。此外，沉默METTL1的表达导致circIPP2A2显著降低角蛋白的富集。研究结果还表明，在HCC中，角蛋白和circIPP2A2的m7g修饰区域（+ 545-683）之间存在强烈的相互作用。以上结果表明，circIPP2A2受mettl1介导的m7G修饰调控，circIPP2A2区域内的m7G修饰在促进角蛋白结合中起关键作用，可能促进HCC的发生或进展。
总结
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本研究建立在前期的研究基础上，即角蛋白在肝细胞癌中调节AKT信号通路。本研究结果表明，circIPP2A2通过mettl1介导的m7G修饰来促进角蛋白和PI3K的相互作用，从而调节AKT/GSK3β信号通路。CircIPP2A2可能作为肝细胞癌患者术后监测和治疗干预的肿瘤标志物。
【参考资料】
https://www.nature.com/articles/s41419-024-07248-7
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