编者按：随着现代科技的发展，以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）为代表的质谱检测法，作为一种快速诊断技术，能够在检测到病原体在培养基上生长后，就能准确鉴别出细菌、病毒、真菌等不同病原体，有望为重症感染的临床诊断缩短时间，为精准治疗提供依据。在近期由四川省国际医学交流促进会主办，四川大学华西医院、四川省国际医学交流促进会重症医学分会、四川大学华西天府医院承办，美国梅奥诊所提供学术支持的“华西-梅奥国际重症医学大会2024”上，西安交通大学第一附属医院重症医学科石秦东教授分享了质谱检测技术在重症感染中的应用。
质谱技术的分类
质谱法，作为一种与光谱法并驾齐驱的重要谱学分析手段，广泛应用于多学科领域，它通过对分子或原子离子的质荷比（m/z）进行精确测量，实现对物质成分的定性与定量分析。该方法的核心在于将待测样品进行电离处理，进而分离出具有不同质荷比的离子，并通过高精度的检测器记录下这些离子的质谱图。这一过程不仅揭示了样品的分子组成与结构信息，还提供了各组分在样品中的相对丰度，展现了质谱法的高特异性与高灵敏度特性。
在病原微生物学鉴定等医学领域，质谱法常用于脂质、代谢物及蛋白质等生物分子的检测与分析。根据离子源与质量分析器的不同设计与配置，目前市场上主流的质谱仪可分为多种类型，包括但不限于MALDI-TOF、timsTOF（离子迁移谱-飞行时间质谱联用仪）、Q-Exactive（高分辨率Orbitrap质谱仪）、tims-QTOF（离子迁移谱-四极杆-飞行时间质谱联用仪）以及Quadrupole（四极杆质谱仪）等。
用于病原微生物学鉴定的质谱技术——MALDI-TOF MS
定义
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是一种新型软电离有机质谱技术，用于分析生物分子（如DNA、蛋白质、多肽、糖类等）和大分子量的有机分子，使得微生物蛋白质指纹图谱进行菌种鉴定成为可能。MALDI-TOF MS技术在微生物学检验中具有检测速度快、鉴定准确率高、检测成本低、检测通量高、可鉴定菌种类型广泛等特点。
MALDI-TOF MS用于病原微生物鉴定的优势与劣势
《MALDI-TOF MS鉴定病原微生物临床应用专家共识》[1]（下称“共识”）推荐MALDI-TOF MS作为细菌、酵母及酵母样真菌鉴定的首选方法之一。MALDI-TOF MS用于病原微生物鉴定，与临床常用微生物鉴定方法包括菌落和镜下形态学、生化、免疫学以及基因测序相比，具有明显的优势：
1.快速、简便、通量高：前处理及上机操作步骤操作简单，短时间内即可完成多标本检测。
2.准确度高：MALDI-TOF MS的鉴定准确率为90.0%~95.0%，显著高于微生物生化鉴定系统。MALDI-TOF MS检测的是保守且具有种特异性的核糖体蛋白，对近缘菌种的区分能力较传统方法更强，尤其对有重要临床意义的菌种鉴定有明显优势。例如对凝固酶阴性葡萄球菌和引起心内膜炎的HACEK群菌种。
3.鉴定范围广：相比生化鉴定方法，MALDI-TOF MS能鉴定更多的临床菌种，除了常见细菌，还适用于分枝杆菌、酵母及酵母样真菌、丝状真菌、专性厌氧菌等。
4.检测成本低：试剂耗材（靶板、试剂、校准品）少、成本低。
MALDI-TOF MS在微生物鉴定方面的局限性主要包括以下几个方面：（1）部分近缘菌种鉴定易混淆。近缘菌种由于核糖体蛋白的内在相似性，使得谱图难以区分，包括但不限于大肠埃希菌/志贺菌属、蜡样芽孢杆菌复合群、肺炎链球菌和缓症链球菌群、洋葱伯克霍尔德菌复合群、鼻疽/类鼻疽伯克霍尔德菌、无色杆菌属、弗劳地柠檬酸杆菌复合群、阴沟肠杆菌复合群、沙门菌属、结核分枝杆菌复合群。随着数据库的扩展和算法的改进，区分以上近缘菌种的能力会逐步改善。（2）混合菌鉴定困难。尽管有不少研究尝试对混合培养物进行鉴定，但尚无可靠的混合菌鉴定系统投入临床使用，目前的MALDI-TOF MS准确鉴定仍需以获得纯菌落为前提。（3）仅适用于可体外培养并形成纯菌落的病原微生物。MALDI-TOF MS目前无法用于耶氏肺孢子菌、衣原体、立克次体等微生物的鉴定。（4）数据库存在局限性。MALDI-TOF MS的微生物鉴定性能依赖于制造商数据库中菌种的覆盖程度，建库菌株的数量和来源，入库谱图的质量等。
不同类型病原微生物的前处理流程
共识推荐MALDI-TOF MS 鉴定不同类型的病原微生物时，采用适宜前处理方法进行操作，其中甲酸乙腈提取法应用范围较广。MALDI-TOF MS 鉴定前处理的主要目的是灭活病原微生物、破坏其细胞壁及提取胞内蛋白质。不同类型微生物细胞壁的结构和成分不同，破壁难易程度有别，从而直接影响蛋白质释放。因此需要选择适当的前处理流程，主要包括：直接涂抹法、原位甲酸提取法、甲酸乙腈提取法、双甲酸法等多种方法。
图1.MALDI-TOF MS鉴定不同病原微生物适用的前处理方法
可直接鉴定的临床标本
共识推荐MALDI-TOF MS直接鉴定血培养阳性标本，按照标准操作流程，可有效缩短标本周转时间（TAT），但应注意其局限性。原则上MALDI-TOF MS鉴定需采用纯菌落，但有部分临床标本无须分纯培养即可直接进行质谱鉴定，包括血培养阳性标本、尿液标本、无菌体液标本，其中用血培养阳性标本直接鉴定较为成熟，能缩短TAT，满足临床快速诊疗的需求。
图2. 血培养阳性病原微生物的MALDI-TOF MS鉴定方法
提高谱图质量
共识推荐采用新鲜菌落进行MALDI-TOF MS鉴定，针对不同病原微生物的特征，选择恰当的前处理方法提高谱图质量。
标本因素方面，建议使用新鲜的菌落进行鉴定，此时微生物处于指数生长期，有利于采集到优质谱图；随生长时间延长，菌龄增加，影响谱图质量。肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、隐球菌等黏液型菌落，由于细胞壁外有荚膜，导致破壁困难，鉴定性能下降，建议使用棉签拂去菌落表面黏液，再挑取下层菌落进行点靶。
点靶操作方面，因操作者手法问题造成点靶质量差，常见于以下几种情况（图3A~3D）。（1）菌量过少（图3B）可能造成谱图信号弱。（2）菌量过多（图3C），涂靶过厚，容易造成谱图分辨率差、质量轴漂移等现象。（3）涂靶不均匀（图3D），自动采集过程中容易采空，或者厚薄不均造成结晶分布不均，影响激光激发效果，重复性差。（4）培养基成分干扰，挑取菌落时混入培养基，涂靶后鉴定容易受到培养基峰的干扰。
图3.MALDI-TOF MS点靶效果示意图（A为菌量适宜）
单个标本重复鉴定出现不同的鉴定结果
共识推荐，单个标本重复鉴定出现不同结果，多是由于鉴定未到种水平所致。可能匹配质谱易混淆的近缘菌种，也可能是由于分辨率不足/数据库菌种缺失导致的匹配到多个低置信度的同属不同种，如有必要需重新制样或进一步补充其他方法进行区分。
微生物鉴定的金标准
共识推荐，不同微生物鉴定方法学的适用性、病原谱、准确率有区别，当MALDI-TOF MS鉴定结果与其他方法不一致，推荐使用基因测序作为鉴定“金标准”。
目前实验室采用全自动微生物生化鉴定仪和MALDI-TOF MS较为广泛，而基因测序可作为难鉴定菌的备选方案。基因测序方法中，Sanger测序能够实现大部分常见微生物的种水平鉴定，但某些菌种（如诺卡菌、非结核分枝杆菌等），其特征核酸序列片段（如16S rRNA）分辨力有限，无法准确鉴定，常需要联合多个特殊性片段测序，甚至需要全基因组测序。
所选择方法的鉴定准确率：目前MALDI-TOF MS鉴定准确率已经接近分子方法，高于生化鉴定。不同方法结果不一致时，基因测序仍被认为是菌种鉴定的“金标准”。
需要鉴定到种的微生物
影响公共健康、与严重疾病相关的病原微生物：细菌，如炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、霍乱弧菌、白喉棒杆菌、单核细胞增生李斯特菌；真菌，如新型隐球菌与格特隐球菌、耳念珠菌等需要报告到种。
菌种间致病性存在差异的病原微生物：例如（1）肺炎链球菌是临床常见的致病菌，而口腔/缓症链球菌常被认为是定植菌。（2）血培养常见污染菌如凝固酶阴性葡萄球菌、棒杆菌属、丙酸杆菌等，若≥2套被检出，应鉴定到种以判断其临床意义。（3）血液或无菌体液中的牛链球菌群常与肠道肿瘤密切相关，应鉴定至亚种水平。
与经验使用抗菌药物相关的病原微生物：例如鲍曼不动杆菌尽管与皮特不动杆菌或医院不动杆菌同属于一个复合群，但鲍曼不动杆菌感染患者往往表现出更高的耐药率和病死率，需要进行区分。真菌中容易产生耐药尤其是多药耐药的菌种，例如耳念珠菌、印度毛癣菌、尖端赛多孢、多育节荚孢霉、东南亚念珠菌等需鉴定到种。
可以鉴定到群的微生物
在不影响临床决策的前提下，当MALDI-TOF MS对复合群内种的区分能力有限或是鉴定到复合群内不常见的种时，推荐将微生物鉴定结果报告到复合群水平。
MALDI-TOF MS对临床常见真菌的鉴定
MALDI-TOF MS可以作为临床常见真菌如念珠菌、隐球菌、曲霉菌的首选鉴定方法之一，对于鉴定不理想的部分丝状真菌，推荐结合其来源、感染部位、菌落形态、显微镜下形态等特征加以判断。
目前MALDI-TOF MS结合自建库鉴定临床常见真菌的进展见表1.
表1. 临床常见真菌MALDI-TOF MS鉴定准确率
质谱检测技术的前景
MALDI-TOF MS在微生物学实验室相关的其他应用领域，特别是耐药和分型方面取得了一定的进展。
1. MALDI-TOF MS应用于耐药菌的检测，包括检测抗菌药物的水解、检测特征峰、脂质质谱检测脂质A、使用机器学习预测耐药、核酸质谱检测耐药基因。
2. 应用于抗菌药物敏感性试验。
3. 进行微生物分型，包括聚类分析、机器学习、智能分型。还可用于近缘菌种/亚种的区分、毒力的预测等其他分型应用。
小结
质谱技术的不断进步推动了重症感染诊治水平的提高，其应用提高了重症感染病原学诊断的准确性。质谱技术缩短了病原学鉴定的时间，使药物的TDM更加快速与准确。
▌参考文献：
1.中华检验医学杂志, 2024,47(09)：1013-1026.
石秦东 教授
西安交通大学第一附属医院
中国共产党党员，毕业于西安交通大学，医学博士，主任医师，硕士研究生导师，西安交通大学第一附属医院重症医学科主任，兼任中国医师协会重症医师分会委员，陕西省重症医学质量控制中心主任委员，陕西省医师协会重症医师分会副会长、陕西省保健学会重症医学分会主任委员等。