人类骨骼的发育始于受孕后的第6至第8周（post-conception weeks, PCW），此时胚胎逐渐进入胎儿期。在头颅区域，骨膜前体细胞通过膜内成骨（intramembranous ossification）途径分化为成骨细胞，并在出生后继续维持骨前体细胞的存在。而在肢体关节的发育过程中，初步的“间区”（interzone）凝聚体会在5到6 PCW出现，并在7到8 PCW形成关节腔，成为关节纤维及韧带结构的发育基础。
为了深入探究骨骼发育中的细胞多样性和调控机制，研究人员采用了单核RNA测序（snRNA-seq）和转座酶可及性染色质测序（snATAC-seq），并结合空间转录组学，对胚胎头骨和肢体发育期间的调控网络进行了深入解析，涵盖了从5到11 PCW的发育时期。该研究采集了来自12个供体的胚胎样本，共获得336,162个高质量的细胞核数据，为解析骨骼发育中的细胞命运转变提供了丰富的数据支持。
为了确保实验数据的可靠性和代表性，研究人员对多个胚胎供体进行了重复采样，并采用统计学手段进行交叉验证。例如，通过计算每个细胞群体的基因表达差异，他们评估了不同发育阶段细胞间的变异性，发现成骨和软骨细胞的发育轨迹在所有供体中表现出高度一致性，这为研究结论提供了坚实的支持。
此外，为了获得更全面的细胞图谱，研究还对特定发育阶段的头颅、四肢和关节区域进行了空间转录组学分析。通过结合基因表达数据和细胞位置数据，研究揭示了在骨骼发育中，特定细胞群体如何随着时间推移在组织中的位置发生动态变化。这些数据为理解胚胎骨骼发育中的空间调控机制提供了关键的线索，也帮助我们深入探讨了发育中的信号梯度和细胞分化路径。
人类胚胎骨骼发育的多组学分析（Credit: Nature）
不同成骨模式的探索
人类骨骼的发育涉及两种成骨模式：膜内成骨和软骨内成骨（endochondral ossification）。头颅顶部骨骼如颅盖骨（calvaria）主要通过膜内成骨发育，而肢体骨骼则通过软骨内成骨发育。这两种成骨模式在时间和空间上表现出显著的差异，反映了成骨细胞命运的区域性调控机制。
通过对胚胎头骨和四肢样本的多组学分析，研究人员揭示了头颅和肢体中成骨前体细胞的不同发育轨迹。具体而言，颅骨中的软骨生成细胞群体相对较少，这与传统的膜内成骨机制相一致。此外，软骨内成骨过程从8 PCW开始逐渐取代关节两侧的软骨支架，形成成熟的骨组织。
在肢体的关节发育中，间区细胞（interzone cells）被认为是软骨和韧带结构的前体。研究中发现特定的细胞群如GDF5高表达的间区细胞（GDF5hi interzone cells），其软骨和成骨转录因子的活性较低，这推测这些细胞在关节形成过程中保持未分化状态，从而支持关节的正常发育。通过基因表达谱分析，GDF5、WNT9A和NOG等关键信号分子在这些细胞中高度表达，这些信号被认为在关节间区的维持和组织结构的形成中具有重要作用。
此外，研究还揭示了在膜内成骨与软骨内成骨之间存在显著的调控因子差异。例如，BMP2和BMP4在软骨内成骨中扮演着重要角色，而在膜内成骨过程中，成骨因子的主要调控因素是RUNX2和SP7（Osterix）。这些因子不仅在空间分布上存在差异，还在染色质可及性上表现出不同的调控模式，进一步强调了两种成骨模式在基因表达和调控网络上的独特性。
胚胎关节形成的时空过程（Credit: Nature）
空间转录组学揭示的细胞区位和发育机制
为了更好地理解细胞在骨骼发育中的空间分布，研究人员开发了一个名为“ISS-Patcher”的新工具，用于将单细胞数据中的细胞标签推测到空间转录组学数据中。利用这一工具，研究团队成功地在高分辨率的胚胎四肢组织切片上精确定位了特定的细胞群体。
例如，在发育中的膝关节区域，研究观察到不同间区细胞在空间上的分布差异。早期间区细胞（early interzone cluster）主要集中在形成中的软骨结构周围，而纤维间区细胞（fibro interzone cluster）则聚集于靠近关节表面的区域。这种空间上的分布差异揭示了不同细胞群体在关节发育过程中的特定功能，并进一步阐明了软骨生成和骨生成过程中的区域性调控机制。此外，通过空间转录组学，研究还观察到在7.3 PCW至10.3 PCW之间，关节腔逐渐形成，间区细胞在关节腔周围的动态变化。
研究还结合了高分辨率的免疫荧光染色，进一步验证了ISS-Patcher工具推测的结果。在膝关节样本中，观察到GDF5标记的间区细胞在关节腔形成的时间点和位置与空间转录组学的预测结果一致，这为空间数据的准确性提供了有力的实验支持。
通过空间转录组学的时间序列分析，研究揭示了不同时间点细胞群体的动态分布及其空间演变。例如，在关节发育的早期阶段，纤维样间区细胞主要分布在关节表面，随着关节腔的形成，这些细胞逐渐向关节腔周围移动并分化为韧带前体细胞。这些发现强调了关节发育过程中细胞在空间和时间上的动态调控，并为理解关节结构的形成提供了更详细的见解。
软骨和成骨的细胞谱系及其调控网络
在骨骼发育过程中，软骨和成骨细胞的分化与成熟是由复杂的基因调控网络严格控制的。通过联合分析基因表达和染色质可及性数据，研究人员绘制了成骨谱系的发育轨迹，揭示了从成骨前体到成熟成骨细胞和骨细胞的逐步分化过程。
在膜内成骨过程中，从7到8 PCW开始，成骨细胞逐渐出现在头颅中，并沿着缝隙（suture）区域向外扩展。研究发现，RUNX2等成骨相关转录因子的表达在不同区域随着时间逐渐增加，反映了成骨谱系在空间上存在的分化梯度。这一梯度揭示了骨骼发育中不同区域的成熟状态，例如RUNX2和SP7（Osterix）在颅骨基底处的高表达，提示这些区域中成骨活性的增强。
研究还结合了染色质可及性测序（snATAC-seq）数据，明确了不同阶段成骨细胞的基因调控元件。结果显示，RUNX2基因启动子区域的开放性与成骨细胞分化紧密相关，并且在8至10 PCW期间逐步增强，表明染色质结构的动态变化在成骨过程中起到关键的调控作用。
此外，研究人员通过ChIP-seq分析确认了RUNX2结合位点的变化，进一步证明了这些结合位点在成骨细胞成熟过程中逐渐开放，并与特定的转录因子结合来激活成骨基因。这些调控机制不仅强调了成骨细胞的谱系特征，还为理解骨生成过程中的表观遗传调控提供了新的见解。
骨骼发育中的血管生成
血管生成在骨骼发育中的作用同样备受关注。在膜内成骨过程中，研究人员发现血管内皮细胞与成骨细胞在同一发育区域内共存，且血管生成相关因子如VEGFA和VEGFB在这些区域内高表达。通过空间转录组学和RNA原位杂交实验，研究揭示了血管生成与成骨过程之间的紧密联系，推测血管生成可能在成骨过程中发挥了促进作用。
具体而言，血管内皮细胞在颅缝区域逐渐聚集，与成骨细胞的共定位现象表明血管在成骨过程中的支持作用。通过NicheNet工具，研究预测了成骨谱系细胞与血管顶端细胞之间的相互作用，这些相互作用可能有助于血管的生长并进一步促进骨组织的矿化。
进一步的实验通过在小鼠模型中阻断VEGFA信号，发现血管生成的受抑制显著延缓了骨生成过程。这一证据强烈支持了血管生成在骨发育中的关键作用，表明血管和成骨细胞之间存在重要的相互作用网络。
为了进一步明确血管在骨生成中的作用，研究人员还在体外模型中进行了共培养实验，发现内皮细胞的存在能够显著促进成骨前体细胞的分化和矿化能力。这些实验结果提供了直接的证据，支持血管生成在骨发育过程中不仅提供营养支持，还通过直接的细胞-细胞相互作用来调控成骨细胞的分化。
神经嵴细胞与非典型软骨生成
有趣的是，研究还发现神经嵴（neural crest）来源的细胞可能参与人类胚胎中的软骨生成。通过细胞轨迹分析和基因表达特征的解析，研究人员发现了一类SOX9阳性的神经嵴细胞（SOX9+ enSC），这些细胞同时表达软骨标志物和神经嵴细胞标志物。RNA-ISH实验显示，这些SOX9+神经嵴细胞在发育中的髋关节软骨中广泛存在，提示它们可能是软骨细胞的一种非典型来源。这为理解软骨生成的多样性提供了新的视角，并可能揭示神经嵴在骨骼发育中的更广泛作用。
通过基因敲除实验，研究人员发现，去除神经嵴特异性标志基因SOX10显著影响髋关节软骨的形成，表明神经嵴细胞在软骨生成中的功能不可或缺。进一步的结果加强了对神经嵴细胞在软骨发育中作用的论据。
此外，研究表明这些神经嵴来源的软骨细胞在特定的力学环境下能够进一步分化为其他类型的软骨细胞，如透明软骨和纤维软骨。通过在体外模拟关节环境，研究人员发现神经嵴细胞在压力环境中更倾向于分化为纤维软骨细胞，这为理解软骨生成中的环境因素提供了新的见解，也为骨关节疾病的治疗提供了潜在的细胞来源。
骨骼发育与疾病风险的关联
骨骼发育过程中的基因调控机制对于成年期的骨关节疾病风险具有重要影响。例如，研究通过SNP2Cell工具，将多基因相关性状（如骨关节炎）与特定细胞类型的基因调控网络关联，发现膝关节和髋关节骨关节炎的风险信号分别富集于软骨和成骨细胞中。这为理解骨骼发育与骨关节疾病的关系提供了新的视角，也为未来的疾病防治研究提供了潜在的靶点。
通过深入分析成骨前体和软骨细胞，研究发现与髋关节骨关节炎相关的信号主要集中在成骨细胞群中，而膝关节骨关节炎的信号则集中于软骨细胞中。这表明不同部位的骨关节炎可能具有不同的发病机制，提示针对性的治疗策略可能更为有效。为验证这一发现，研究人员进行了功能性验证实验，发现与骨关节炎相关的基因敲除小鼠在相应部位表现出显著的骨密度降低和关节异常，这进一步支持了这些基因在疾病发生中的关键作用。
研究还对与骨关节炎相关的遗传易感性进行了表观遗传调控的探索，发现染色质结构的变化可能是某些基因在关节疾病中发挥作用的关键因素。例如，H3K27ac修饰在骨关节炎相关基因启动子区域的增强提示了这些基因的过度表达与疾病的进展之间的关联性。结合ATAC-seq数据，研究人员能够描绘出在骨关节炎患者中染色质开放性变化的特定模式，为理解表观遗传调控在骨关节疾病中的作用提供了新的视角。
通过多组学手段，研究人员绘制了详细的人类胚胎骨骼发育图谱，揭示了从细胞水平到基因调控网络的复杂过程。这项研究不仅加深了我们对骨骼和软骨发育的理解，也为骨关节疾病的预防和治疗提供了新的方向。未来，随着更多先进技术的应用，我们有望进一步揭示骨骼发育中的更多细节，为骨骼相关疾病的诊断和治疗带来更多可能性。
该研究强调了细胞命运决定、空间分布及基因调控网络在骨骼发育中的关键作用，揭示了不同成骨模式和软骨生成过程的区域性特征。这些发现对于理解人类骨骼的正常发育及相关疾病的发生机制具有重要意义，也为新治疗方法的开发提供了理论基础。未来的研究或许可以进一步探索这些发现的功能验证，并将这些知识应用于骨骼疾病的临床治疗中。
此外，该研究还为理解环境因素对骨骼发育和疾病发生的影响提供了新见解。例如，力学应力和局部微环境的变化如何影响细胞分化路径，以及如何通过调节这些环境因素来促进骨骼和软骨的修复，将是未来研究的重要方向。这些发现不仅有助于基础科学的进步，也为再生医学和组织工程提供了实际应用的前景。
参考文献