MRD 检测新突破：如何验证技术性能，实现临床高效应用？

在 MRD 检测可以既少抽血又保证结果准确吗？一文中，我们阐述了为什么要做 MRD 检测，在实践中该如何减少抽血量，又可以通过技术方法提高检测准确性；

在 MRD 检测是否有必要做、怎么做？从临床研究到诊疗应用一文中，我们对 MRD 的检测价值，即临床研究做了深入地阐述，包括但不局限于预后分析、复发监测、疗效预测、药物假期等。

实体瘤 MRD 检测从 2021 年至今一共发布 3 个专家共识，共识包含的技术相关意见内容越来越详实，这说明精准医学领域对 MRD 检测的理解越来越深刻，业内正逐步形成规范的检测标准。

•《非小细胞肺癌分子残留病灶专家共识（2021 版）》中关于非小细胞肺癌 MRD 检测的基本技术要求：

a）基本技术标准是可稳定检出丰度 ≥ 0.02％ 的 ctDNA；

b）MRD 评估报告中必须包括 cfDNA 丰度，ctDNA 丰度，所检测基因 VAF 值。

•《胃癌分子残留病灶检测与临床应用中国专家共识（2023 版）》关于胃癌 MRD 检测的技术推荐意见：

a）肿瘤先验分析可能更符合临床需求；

b）为有效提高 ctDNA 检出丰度，每次抽取 ≥ 10 mL 外周血；

c）推荐采用多基因 panel 检测；

d）对于围手术期的胃癌患者测序深度需要 > 3,0000×。

•《实体瘤分子残留病灶（MRD）检测共识（2024 版）》技术推荐意见：

a）未来的临床实践中，可综合评估后选择群体定制、个性化定制或二者结合的方式；

b）优先考虑采用 tumor-informed 分析策略；

c）实体瘤 MRD 的 Landmark 检测（治疗后首次检测）大多选择在根治性治疗后 1 个月内进行，MRD 动态监测有助于提升检测性能；

d）实体瘤 MRD 检测在临床应用前需经过充分的性能验证。MRD 检测通常追踪多个突变，需从患者/样本层面评估 MRD 检测的性能；

e）推荐追踪多个突变，测序深度推荐 > 3,0000×，个性化定制panel 测序深度可考虑 > 10,0 000×；

f）MRD 检测需设置质控品，质控品应包含已知阳性/阴性的突变，用于监控检测流程的稳定性和检测的准确性；

g）检测报告应包括检测范围、检测方法、质控结果、MRD 阳性/阴性判定规则，检测限、检测局限性等。

针对上述专家共识，国内外大量的临床及第三方检验所纷纷进行技术创新，在肿瘤先验分析和肿瘤未知分析两大技术策略上百家争鸣：

肿瘤先验分析。肿瘤组织和配对白细胞进行全外显子测序，筛选 16 个主克隆体细胞突变位点设计多重引物 pool 检测 ctDNA，测序深度 10,0000x，样本水平检出 ≥ 2 种突变判定为 MRD 阳性。50～66 ng 标准品建库进行技术性能验证，LOD（最低检测线） 0.01%，特异性 > 99.5%^[1]。

肿瘤先验分析。肿瘤组织和配对白细胞进行全外显子测序，组织 ≥ 150x，白细胞 ≥ 20x，筛选 18-50 个体细胞突变位点，设计带 UMI 的多重锚定 PCR Panel（anchored multiplex polymerase chain reaction, AMP™）检测 ctDNA。利用 SNP 判断肿瘤样本、对照样本和血浆样本是否来自同一个体，UMI 矫正，Panel 包含 50 个突变位点时要求术前基线血浆突变的测序深度 ≥ 10,000x，术后监测血浆突变的测序深度 ≥ 30,000x，当 Panel 包括的突变数量不足 50 时，需要调整测序深度的要求。突变使用背噪模型和离群 AF 进行 QC，将样本所有通过 QC 的突变支持 read 数与预计的突变支持 read 数进行单尾泊松检验，p < 0.01 的术前基线血浆样本判定为 ctDNA 阳性，p < 0.001 的术后监测血浆样本判定为 ctDNA 阳性。60ng cfDNA 的投入量以及 18～50 个突变位点设计的个性化 Panel 时，术前基线样本的 LOD 可以达到 0.008%。使用 10 ng cfDNA 的投入量以及 18 个突变位点设计的个性化 Panel 时，术后监测样本的 LOD 可以达到 0.05%^[2]。

肿瘤先验分析。FFPE 肿瘤组织和配对白细胞用 WES 捕获测序，组织 500x，白细胞 150x。筛选 50 个突变设计液相捕获 Panel。20 ng 和 60 ng DNA 投入量构建 6bp UMI 文库，每个样本至少使用 1 ug 文库捕获，100,000× 的原始测序深度下，LOD 分别为 0.0036% 和 0.0018%。具体的样本 MRD 阳性判断值方法：1，检测到的突变满足下列两种条件之一纳入后续分析：a） 突变有双链共有序列（duplex consensus sequence，DCS）支持且至少 one side 单链共有序列（single-stranded consensus sequence，SCS）family size ≥ 2，b）突变只有 SCS 支持，但是 SCS family size ≥ 3。2，根据背噪频率、突变的位点深度和支持 reads 数目，通过泊松分布计算，p < 0.05 的突变判断为阳性突变。3，在样本水平基于最大似然方法进行统计，p < 0.005% 判断为样本 MRD 阳性^[3]。

肿瘤先验分析。肿瘤组织和配对白细胞进行定制版全外显子（重点区间加深覆盖）测序，筛选 50 个体细胞突变位点设计个性化液相捕获 Panel，对血浆进行 10,0000x 测序，30 ng DNA 投入量构建 UMI 文库，LOD 0.0025%^[4]。

肿瘤未知分析。30 ng cfDNA 建库，捕获 > 20,000 个甲基化区域，分析癌种相关的差异甲基化区域（DMR）的甲基化水平，根据预定义的阈值判定样本是 MRD 阳性或阴性^[5]。

艾吉泰康作为一家专注靶向捕获及 MRD 方案的试剂供应商，推出的免费定制 MRD Panel 的方案已被多家临床和检验所使用。基于 Tumor informed 策略，每个 Panel 可免费合成最高 150 根探针，相比于常规柱式单根合成的方案，在成本降到最低的情况下快速满足大样本量下定制需求。

这一快速交付能力依赖于艾吉泰康自有的高通量核酸合成仪，能够全流程精准把控，从接收用户提交的 MRD 位点开始，可实现自动设计探针、自动补充突变型探针，自动完成设计并下单合成，确保在 5 个工作日内交付。

直观、清晰、简洁的 MRD 探针设计界面，用户可以轻松操作 MRD Panel 设计功能。用户能够根据个人需求定制 MRD Panel，包括选择特定的基因和变异位点，以适应不同癌种和个体化需求。

艾吉泰康经过多年自主研发配套试剂以及不同场景下的应用拓展，已形成自样本提取、建库、捕获以及生信分析的 MRD 完整解决方案，各环节均可搭配自动化设备稳定、高效使用。

MRD Panel 的探针常温保存 3 天和 7 天后进行捕获测试，对照探针在 -20 度保存。测试数据表明 MRD Panel 在室温保存 3～7 天后捕获性能没有明显降低，中靶率 > 75%，100% 的区域深度超过平均深度的 50%。

图 1. MRD Panel 探针保存稳定性的数据表现。采用 34 个位点的 MRD Panel 进行测试，单杂文库投入量为 750 ng，NovaSeq 6,000 平台 PE150 测序。

MRD Panel 的探针反复冻融 10 次和 20 次后进行捕获测试，对照探针在 -20 度保存，测试数据表明 MRD Panel 反复冻融 10 次和 20 次后捕获性能没有明显降低，中靶率 > 58%，100% 的区域深度超过平均深度的 50%。

图 2. MRD Panel 探针冻融稳定性的数据表现。采用 25 个位点的 MRD Panel 进行测试，单杂文库投入量为 750 ng，NovaSeq 6,000 平台 PE150 测序。

基于艾吉泰康 MRD Panel 整体解决方案，统计真实世界中 33 例患者基于 tumor-informed 策略，合成的 33 个不同的 MRD Panel（包含 15～150 个位点）进行捕获性能测试。所有测试的 MRD Panel 都具有优秀的捕获性能：中靶率 > 55%，覆盖度100%，> 97% 的区域深度超过平均深度的 20%，> 91% 的区域深度超过平均深度的 50%。

图 3. 不同 MRD Panel 进行捕获测试的数据表现。采用 33 个 MRD Panel 进行捕获测试，单杂文库投入量为 750 ng，NovaSeq 6,000 平台 PE150 测序。

使用 37 个位点的 MRD panel 检测不同突变频率的 ctDNA 标准品，0.1% 和 0.01% ctDNA 标准品在样本水平检测灵敏度均达到100%。

表 1 不同突变频率 ctDNA 标准品的检出率

使用突变频率为 0.1% 、0.01%、 0.001% 的 Horizon ctDNA 标准品（HD780，包含 8 种突变）进行 50 ng 投入量下建库（3 次技术重复），使用 37 个位点的 MRD Panel 进行捕获，下机数据使用艾吉泰康^®搭建的 UMI 流程分析，样本水平检出 ≥ 2 种突变定义为检出阳性。

内容策划：邹礼平

内容审核：朱卿

题图来源：图虫创意

参考资料