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随着全球人口老龄化的加剧，神经退行性疾病成为影响老年人生活质量的重要因素之一。神经干细胞（Neural Stem Cells, NSC）作为脑内再生能力的关键细胞类型，在维持大脑功能方面扮演着至关重要的角色。然而，随着年龄的增长，NSC的功能逐渐衰退，这被认为是导致多种神经系统疾病发生发展的重要原因之一。近期，一项发表在《Nature》上的研究《CRISPR-Cas9 screens reveal regulators of ageing in neural stem cells》，通过基于CRISPR-Cas9基因编辑的筛选技术揭示了NSC衰老过程中的关键调控因子，为延缓神经干细胞衰老提供了新的理论依据和技术手段。
神经干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，能够在特定条件下分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等，从而参与大脑发育和修复过程。然而，随着个体年龄的增长，NSC的数量和活性均显著下降，导致其再生能力减弱，进而影响大脑健康。因此，探索NSC衰老的分子机制对于预防和治疗与年龄相关的神经退行性疾病具有重要意义。
本研究采用了CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建了针对小鼠NSCs的全基因组敲除文库，通过体内外筛选实验，系统地鉴定了影响NSC衰老的关键基因。体外筛选阶段（图1a），研究团队首先分别从年轻（3-4月龄）和老年（18-21月龄）且表达Cas9的小鼠脑室下区（SVZ）分离出NSC，并诱导成静息态，然后使用承载不同sgRNA的慢病毒同时转染。这些不同的sgRNA靶向约23000个基因，这样就能同时获得这些基因被敲除的NSC，便于后续筛选。通过sgRNA测序来确认敲除相应基因的细胞丰度。
通过这种研究人员首先筛选了与NSC激活相关的基因。生长因子刺激之后，老年NSC的活化能力显著弱于年轻NSC，而CRISPR/Cas9筛选技术筛选出654个基因，敲除后促进了NSC激活，以及1386个基因，敲除后抑制NSC激活。其中，143个基因的敲除能同时促进年轻和老年NSC的激活，而210个基因的敲除仅对年轻NSC的激活有促进作用，301个基因仅对老年NSC有促进作用，表一些NSC静止/激活调节因子会随着年龄的变化而变化。GO分析显示促进老年NSC激活的敲除基因富集在纤毛组织、细胞质核糖核蛋白结构以及葡糖糖转运。
图1：CRISPR-Cas9筛选揭示神经干细胞衰老的关键基因
为了测试基因敲除是否也能增强体内神经干细胞功能，研究者又开发了一个针对老年大脑的基因敲除筛选平台。研究人员将sgRNA表达和mCherry表达的慢病毒注射到老年Cas9小鼠侧脑室，并在5周后我们收集整个嗅球（NSC来源的新生细胞会迁移到嗅球）进行sgRNA的全基因组测序（图2a）。研究人员建立了5个基因文库，每个基因文库包好10个基因，并在小鼠平台上验证了这5个文库的基因。这5个文库分别为：（1）在体外筛选中敲除后可促进老年NSC激活的基因“前10”基因；（2）“葡萄糖摄取/人类疾病”相关基因文库，同时也是体外筛选中敲除后可促进老年NSC激活的基因；（3）“细胞质核糖核酸蛋白结构”相关基因库，其中一部分基因的敲除也在体外筛选中促进了老年NSC激活；（4）体外筛选中敲除后抑制年轻/老年NSC激活的基因；（5）“已发表的NSC调节因子”基因库（图2e）。实验结果验证了其中24个基因的敲除能够促进NSC激活，其中“葡萄糖摄取/人类疾病”相关基因文库的富集是最强的，而编码葡萄糖转运体GLUT4的基因Slc2a4的敲除在体内外的结果最为一致。
图2：CRISPR-Cas9筛选揭示神经干细胞衰老的关键基因
在此基础上，研究人员还发现SVZ区GLUT4的表达在星形胶质细胞和静息NSC中的表达随年龄增加；同时，敲除SVZ区GLUT4能够促进NSC增殖和神经发生。其它葡萄糖转运体的敲除则没有类似作用。年老NSC的葡萄糖摄取相较于年轻NSC显著增加，而Slc2a4敲除能降低老年NSC的葡萄糖摄取。年老NSC的糖酵解增强而氧化磷酸化减弱，提示年老NSC线粒体功能的衰退。Slc2a4敲除会抑制年轻NSC的糖酵解和氧化磷酸化，而仅抑制年老NSC糖酵解。短暂的葡萄糖剥夺同样能改善年老NSC的激活，而非年轻NSC的激活。葡萄糖代谢特征与神经干细胞的静息状态有关，而本研究进一步揭示了葡萄糖代谢在衰老的神经干细胞中的作用。
图3：CRISPR-Cas9筛选揭示GLUT4是神经干细胞衰老的关键基因
图4：CRISPR-Cas9筛选揭示神经干细胞衰老的关键基因
综上，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术进行的体内外筛选实验，该研究团队进一步分析了在神经干细胞（NSCs）衰老过程中起关键作用的基因，特别是葡萄糖转运蛋白GLUT4（由Slc2a4基因编码）的作用。研究团队发现，老年NSCs中GLUT4的表达显著增加，导致葡萄糖摄取能力增强。通过敲除Slc2a4，研究者显著提高了老年NSCs的激活效率，验证了GLUT4在NSCs衰老中的关键作用。降低葡萄糖摄取可以改善老年NSCs的激活。这些发现不仅深化了对NSCs衰老机制的理解，也为开发延缓神经干细胞衰老的新策略提供了重要依据。
除了上述发现外，该技术还可以用于其他领域的研究。
1. 肿瘤学领域的应用
CRISPR-Cas9筛选技术在肿瘤学领域的应用已经取得了显著进展。通过构建全基因组敲除文库，研究者可以系统地鉴定出驱动癌症发生发展的关键基因。例如，研究者可以通过CRISPR-Cas9技术在肿瘤细胞中进行基因敲除，筛选出对肿瘤生长和转移至关重要的基因。这些基因可以作为潜在的治疗靶点，为开发新型抗癌药物提供重要线索。此外，CRISPR-Cas9技术还可以用于研究肿瘤细胞的耐药机制，通过基因编辑技术揭示肿瘤细胞对特定药物产生耐药性的分子机制，为克服耐药性提供新的策略。
2. 遗传病治疗领域的应用
CRISPR-Cas9技术在遗传病治疗领域的应用也展现出巨大的潜力。许多遗传病是由单个基因的突变引起的，传统的治疗方法往往难以根治。通过CRISPR-Cas9技术，研究者可以在患者体内直接纠正致病基因的突变，从而达到治疗目的。例如，对于囊性纤维化、β-地中海贫血等遗传病，研究者已经成功利用CRISPR-Cas9技术在动物模型中实现了基因矫正，显示出良好的治疗效果。此外，CRISPR-Cas9技术还可以用于基因编辑疗法的个性化定制，根据每个患者的基因突变情况进行精准治疗，提高治疗效果。
3. 农业生物技术领域的应用
CRISPR-Cas9技术在农业生物技术领域的应用同样具有广阔前景。通过基因编辑技术，研究者可以对作物的基因进行精确修改，培育出具有抗病、抗虫、耐旱等优良性状的新品种。例如，研究者已经利用CRISPR-Cas9技术成功培育出抗稻瘟病的水稻品种，显著提高了水稻的产量和品质。此外，CRISPR-Cas9技术还可以用于改良动物品种，提高其生产性能和抗病能力，为农业生产提供强有力的技术支持。
4. 基础生物学研究的应用
CRISPR-Cas9技术在基础生物学研究中的应用也非常广泛。通过基因编辑技术，研究者可以精确地敲除或敲入特定基因，研究这些基因在细胞和生物体中的功能。例如，研究者可以利用CRISPR-Cas9技术在模式生物（如小鼠、斑马鱼等）中进行基因功能研究，揭示基因在发育、代谢、免疫等生物学过程中的作用。此外，CRISPR-Cas9技术还可以用于构建复杂的基因调控网络，研究基因之间的相互作用关系，为理解复杂生物学现象提供新的视角。
本研究采用的CRISPR-Cas9基因编辑技术及其高通量筛选平台，不仅为揭示NSCs衰老机制提供了有力工具，同时也为开发延缓神经干细胞衰老的新策略提供了重要的科学依据。总之，随着基因编辑技术和代谢干预策略的不断进步，相信未来我们将能够更好地应对老龄化带来的挑战，为老年人提供更加优质的医疗保健服务。
注：本文旨在介绍医学研究进展，不做治疗方案推荐。如有需要，请咨询专业临床医生。
参考文献
Ruetz TJ, Pogson AN, Kashiwagi CM, Gagnon SD, Morton B, Sun ED, Na J, Yeo RW, Leeman DS, Morgens DW, Tsui CK, Li A, Bassik MC, Brunet A. CRISPR-Cas9 screens reveal regulators of ageing in neural stem cells. Nature. 2024 Oct;634(8036):1150-1159.