Adv Sci | 李晓明/陈家东团队揭示杏仁核调控癫痫的新神经环路机制

2024年10月31日，浙江大学脑科学与脑医学学院、双脑中心李晓明/陈家东团队在Advanced Science杂志发表了题为“Posterior Basolateral Amygdala is a Critical Amygdaloid Area for Temporal Lobe Epilepsy”的研究论文，该研究揭示了后基底外侧杏仁核（pBLA）谷氨酸能神经元在癫痫发生和传播中的神经环路，并在TLE小鼠模型中确定pBLA是调节癫痫发作的杏仁核复合体中的关键核团。

为了操控C57BL/6J小鼠中pBLA的谷氨酸能神经元，研究人员使用了CaMKIIα启动子介导的腺相关病毒（AAV）工具。在小鼠的pBLA注射了AAV-CaMKIIα-ChR2-mCherry或AAV-CaMKIIα-mCherry的AAV，并在两侧植入光纤以光遗传学方式刺激pBLA中的谷氨酸能神经元（图1A）。脑电图（EEG）记录显示，光遗传学激活pBLA谷氨酸能神经元引起了持续39.75±5.31秒（n=6只小鼠）的显著癫痫样放电（图1D），显著增加了五种不同频率脑波的功率：δ波（0.5-4 Hz）、θ波（4-8 Hz）、α波（8-12 Hz）、β波（12-30 Hz）和γ波（30-500 Hz）（图1E）。这种激活还导致了5-6级癫痫发作（图1F），并引发了其他癫痫症状，包括瞳孔扩大和口吐白沫。值得注意的是，pBLA谷氨酸能神经元的短暂30秒激活可能导致动物突然死亡（癫痫阶段6；六只小鼠中有三只）。相比之下，光遗传学激活前基底外侧杏仁核（aBLA）的谷氨酸能神经元并未引起癫痫发作。

图1 光遗传激活pBLA谷氨酸能神经元可诱发癫痫症状甚至死亡

癫痫发作的特点是突发且短暂，其症状源于大脑中神经元的过度放电和同步的神经元活动。因此，pBLA谷氨酸能神经元可能向不同的大脑区域发出侧枝投射，介导这种同步的神经元活动。为了调查潜在的侧枝投射模式，研究人员在BNST中给予逆行（Retro）-AAV-hSyn-Cre和AAV/9-DIO-EGFP的混合物，在pBLA中给予AAV-DIO-mCherry（图2A）。研究人员发现pBLA→BNST神经元（从BNST逆行标记的pBLA神经元）会向mPFC、IC、BNST、CeA和VMH发出侧枝投射（图2B）。此外，在相同的小鼠中进行了双重逆行标记实验，从不同的下游靶标回溯：BNST和CeA，IC和BNST，以及IC和CeA。这些实验揭示了pBLA标记神经元的显著重叠，其中69%的神经元从BNST和CeA双重标记，60%从BNST和IC双重标记，以及63%从IC和CeA双重标记。

图2 用AAV逆行标记pBLA投射神经元

研究人员选择在BNST中注射Retro-AAV-hSyn-Cre，在pBLA中注射AAV-DIO-GCaMP6s来示踪这些神经元的钙活动（图3D）。然后，使用活体光纤记录系统，在海马内注射红藻氨酸（KA）诱导的急性癫痫模型中监测侧枝投射pBLA神经元的钙活动。通过将钙信号与脑电图信号EEG相结合，研究人员观察到侧枝投射pBLA神经元的钙活动与EEG信号同步并显示出正相关（图3E-G）。然而，aBLA→BNST神经元的钙活动在海马内KA诱导的急性癫痫模型中并没有显示出与EEG信号强烈的相关性（图3H-K）。此外，aBLA-BNST环路的光遗传学激活也没有产生癫痫样放电或癫痫发作。

图3 侧支投射的pBLA神经元钙信号与癫痫发作活动同步

研究证明光遗传激活投射到IC、BNST或CeA的pBLA谷氨酸能轴突终末的可诱发癫痫样放电和癫痫行为。为了进一步确定IC、BNST或CeA中哪一个是pBLA谷氨酸能神经元驱动癫痫的关键下游区域，选择性激活接收来自pBLA的投射的IC、BNST或CeA中的神经元。在pBLA注入顺行跨突触Antero-AAV2/1-hSyn-Cre，向IC、BNST或CeA注入AAV-DIO-ChR2-EGFP，随后在IC、BNST或CeA上方植入光纤（图4A,B）。光遗传学激活pBLA靶向的IC神经元导致显著的癫痫样放电和癫痫行为，以及五个不同EEG频带功率的显著增加（图4C-E）。相比之下，光遗传学激活接收pBLA投射的下游BNST或CeA神经元并没有诱导癫痫样放电或癫痫，也没有显著增加五个不同EEG频带的功率（图4F-K）。这些发现表明IC是pBLA谷氨酸能神经元驱动癫痫的关键下游区域。IC神经元的凋亡减轻了由pBLA谷氨酸能神经元激活引起的癫痫样放电，显著降低了癫痫发作期间五个不同EEG频带的功率，并且明显减轻了动物的癫痫行为严重程度，而BNST或CeA神经元的凋亡并没有引起这种现象。

图4 光遗传激活靶向IC的pBLA神经元可诱发癫痫样放电和癫痫发作

在BNST GABA+神经元与pBLA神经元之间，以及CeA GABA+神经元与pBLA神经元之间存在相互投射。为了确定pBLA中哪些类型的神经元接收来自BNST GABA+或CeA GABA+神经元的反馈抑制，研究人员向C57BL/6J小鼠的BNST或CeA注射了顺行跨突触Antero-AAV-hSyn-EGFP和逆行Retro-AAV-hSyn-mCherry的混合物（图5A,H）。从BNST GABA+或CeA GABA+神经元接收投射的pBLA神经元被EGFP标记，而向BNST GABA+或CeA GABA+神经元投射的pBLA神经元被mCherry标记（图5B,I），FISH染色显示BNST GABA+或CeA GABA+神经元与pBLA中的谷氨酸能神经元形成突触连接，大部分向BNST GABA+或CeA GABA+神经元投射的pBLA谷氨酸能神经元也接收来自BNST GABA+或CeA GABA+神经元的反馈投射。

为了进一步确定BNST GABA+或CeA GABA+神经元与pBLA谷氨酸能神经元之间的突触连接性质，研究人员进行了全细胞膜片钳电生理记录实验（图5D,K），结果显示光刺激从BNST或CeA投射到pBLA的轴突末梢时，在超过70%的mCherry标记的pBLA谷氨酸能神经元中诱发了抑制性突触后电流（eIPSCs），而不是兴奋性突触后电流（eEPSCs）（图5E,G,L,N）。此外，光遗传学激活pBLA谷氨酸能神经元对BNST GABA+或CeA GABA+投射的轴突末梢，结果显示表现出单突触抑制反应，记录到的eIPSCs被电压门控钠通道阻断剂河豚毒素（TTX, 1μM）阻断，随后被钾通道阻断剂4-氨基吡啶（4-AP, 100μM）恢复，并且被GABAA受体拮抗剂匹可毒素（PTX, 100μM）消除（图5E,F,L,M），结合病毒示踪、FISH和膜片钳电生理记录的结果，BNST GABA+或CeA GABA+神经元对pBLA谷氨酸能神经元形成了反馈抑制（图5B,C,I,J）。

图5 BNST GABA+和CeA GABA+神经元对pBLA谷氨酸能神经元形成反馈抑制

为了确定引发癫痫发作的pBLA谷氨酸能神经元的上游输入，研究人员采用了狂犬病病毒（RV）逆行跨单突触示踪策略。将Retro-AAV-hSyn-Cre注入BNST，并将Cre依赖的RV辅助病毒（AAV-EF1α-DIO-RVG和AAV-EF1α-DIO-TVA-EGFP）注入pBLA。两周后，在pBLA注入了G蛋白缺陷的狂犬病病毒（RV-EnvA-ΔG-dsRed）（图6A,B），并在注射后一周检查RV的表达，实验结果显示pBLA谷氨酸能神经元接受腹侧海马CA1（vCA1）脑区的神经输入（图6C）。此外，研究人员将AAV-CaMKIIα-mCherry注入腹侧海马（vHIP）进行顺行追踪，发现从vHIP到pBLA有广泛的兴奋性轴突末梢投射，但并未投射到其他杏仁核如aBLA和CeA（图6E,F）。

图6 从pBLA神经元投射到BNST的单突触逆行追踪

为了测试激活vCA1-pBLA神经环路是否足以引发癫痫发作，研究人员在C57BL/6J小鼠的vCA1注入AAV-CaMKIIα-ChR2-mCherry或AAV-CaMKIIα-mCherry，并在pBLA上方植入光纤。光遗传学激活vCA1-pBLA神经环路引发了癫痫样放电和癫痫行为。相比之下，尽管pBLA神经元也接收来自梨状皮质（Pir）和丘脑室旁核前部（aPVT）的突触输入（图7G），光遗传学激活兴奋性的Pir-pBLA或aPVT-pBLA神经环路并未引发癫痫样放电或癫痫行为（图7H-J）。

图7 光遗传激活vCA1-pBLA环路

为了研究在由海马内注射KA诱导的颞叶癫痫（TLE）小鼠模型中，消融pBLA中的谷氨酸能神经元是否能够减轻癫痫发作，研究人员在pBLA双侧注射了AAV-DIO-DTA和AAV-CaMKIIα-Cre的混合物（图8B）。病毒注射后四周，观察到在DTA双侧注射的小鼠中pBLA区域的NeuN阳性细胞减少。通过植入的导管向海马CA1区域给予KA后，对小鼠进行了60分钟的监测，以评估癫痫行为和颅骨表面的EEG信号（图8A）。消融pBLA神经元的小鼠在EEG功率谱和GS严重程度上都显示出显著降低（图8C,D）。消融pBLA神经元还显著降低了急性癫痫发作期间的致命结果（图8E）。EEG信号的频谱分析表明，五种类型的脑波功率都大幅降低（图8F）。总的来说，消融pBLA谷氨酸能神经元是一种强有力的干预措施，可以抑制KA诱导的急性癫痫发作，并降低严重癫痫相关死亡的风险。

图8 消融pBLA谷氨酸能神经元可以抑制KA诱导的急性癫痫发作

接下来，研究人员探索了消融pBLA谷氨酸能神经元是否能够抑制KA诱导的慢性自发性癫痫发作。在海马注射KA，双侧引入AAV-DIO-DTA和AAV-CaMKIIα-Cre进行pBLA神经元消融，并在颅骨表面放置电极进行EEG记录。在KA注射后七周，每天观察超过8小时对小鼠进行评估，连续5天评估自发性高电压尖峰（> 0.5 mV）（图9G）。消融pBLA谷氨酸能神经元显著减少了自发性高电压尖峰的数量（图9H,I）。在pBLA消融的小鼠中也未观察到GSs（图9J,K）。这些发现表明，消融pBLA神经元有效地减轻了慢性TLE模型中的癫痫发作。

图9 pBLA神经元消融减轻慢性TLE模型中的癫痫发作

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