结直肠癌在我国的发病率呈逐年上升的趋势，世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC) 数据显示，我国 2020 年结直 肠癌的新发病例数为 56 万例，因结直肠癌死亡病例达 29 万例。约 25%的结直肠癌患者在诊断时已出现远处转移，此外，25%的患者在治疗过程中发生转移，晚期患者预后较差，5 年生存率不足 15%。
结直肠癌的早期筛查及预防可以降低发病率、提高治愈率，相关分子标志物的检测是结直肠癌筛查的有效补充，同时对个体化方案的判定、预后判断及疗效预测等方面起到重要作用。
对 Ras、BRAF、错配修复/微卫星不稳定( MMR/ MSI) 等肿瘤相关分子标志物的深入研究及检测水平的发展，合理的检测技术及应用已经成为目前临床实践重要的组成部分。
结直肠癌分子标志物检测的适应证与时机
遗传性结肠癌筛查和基因诊断
Ⅰ～Ⅲ期结直肠癌治疗阶段及检测时机推荐
Ⅳ期结直肠癌治疗阶段及检测时机推荐
结直肠癌诊疗的相关生物标志物
以下是详细介绍分子标志物
一、常规分子标志物检测
1. RAS基因点突变
KRAS和NRAS是由RAS家族成员基 因 编 码 的 两 种 GTP 酶 蛋 白 ，参 与 表 皮 生 长 因 子 受 体 （EGFR）的信号转导，调控细胞生长、分化、增殖和存活。
40%~50%的结直肠癌患者存在 KRAS 点突变；3.8% 的结直肠癌存在 NRAS 基因点突变。需要检测的位点包括KRAS和NRAS基因的第2、3、4号外显子。根据目前现有指南及临床实践，推荐以5%作为组织学的RAS基因检测的突变丰度截断值。目前已有多项临床研究表明，RAS野生型的晚期结直肠癌患者能从抗EGFR单抗治疗中获益，患者的总生 存时间显著延长。尤其对于原发灶位于左半结肠和直 肠的患者，接受化疗联合抗EGFR单抗治疗的患者中位总生存期可达到55个月以上。因此，对于这部分患者推荐首选化疗联合抗EGFR单抗的治疗方案。而对于RAS基因突变患者，应用抗EGFR单抗则无明确获益，一般采用化疗联合 VEGF 单抗治疗。因此，推荐在 mCRC 患者开始治疗前，应进行RAS突变的检测，有助于帮助患者选择最佳的个体化治疗方案。
2. BRAF基因点突变
BRAF基因作为RAF原癌基因家族的成员，位于 RAS 基因下游，是 RAS⁃RAF⁃MEK 激酶通路上的关键成员。在亚洲结直肠癌患者中，BRAF 突变率为5.4%~6.7%。另有研究显示，BRAF 基因突变的转移性结直肠癌患者中，90%为BRAF V600E突变。NCCN指南和CSCO指南对BRAF V600E突变mCRC患者的二线治疗均推荐西妥昔单抗+伊立替康+维莫非尼（BRAF抑制剂），或者西妥昔单抗+ BRAF 抑制剂± MEK 抑制剂的联合方案。BRAF基因状态对结直肠癌患者的预后评估也具有指导意义。BRAF V600E突变患者相比其他患者预后更差，生存时间更短。另外，对于林奇综合征的诊断，MLH1突变患者必须加做MLH1甲基化或BRAF V600E突变检测，如有BRAF V600E突变则不能确诊为林奇综合征。因此，推荐在结直肠癌患者中进行BRAF V600E突变检测，可用于选择个体化治疗方案、帮助林奇综合征的诊断以及患者的预后判断。
3. 微卫星不稳定（MSI）状态和错配修复（MMR）蛋白表达
MSI 状态和 MMR蛋白表达是包括结直肠癌在内的泛瘤种免疫检查点抑制剂效果的预测指标。对相关细胞DNA微卫星的长度改变来决定MSI状况。根据微卫星的不同状况可将患者分为3种，即：高度微卫星不稳定（MSI⁃H）、低度微卫星不稳定（MSI⁃L）和微卫星稳定（MSS）。通常采用美国国家癌症研究所推荐的5个微卫星位点进行检测，当≥2个微卫星位点显示MSI，即可诊断为MSI⁃H；1个显示MSI，可诊断为MSI⁃L；没有任何位点显示MSI，即MSS。
MMR蛋白的IHC检测，需同时检测4个常见MMR蛋白（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）的表达。其中≥1 种表达缺失，判定为错配修复基因缺陷（dMMR）；全部阳性，则判定为错配修复基因完整（pMMR）。一般而言，dMMR相当于MSI⁃H，pMMR相当于MSI⁃L或MSS。
MSI⁃H状态的Ⅱ期和Ⅲ期结直肠癌患者，其预后一般优于MSS患者。MSI⁃H的Ⅱ期患者，一般预后较好，且不能从氟尿嘧啶（5⁃FU）类单药化疗中获益，所以建议Ⅱ期患者术后常规进行MSI检测。此外，转移性MSI⁃H/dMMR患者对于免疫检查点抑制剂疗效较好。Checkmate142研究表明，纳武单抗有效率为31%。而非MSI⁃H/dMMR患者有效率则显著较低。KEYNOTE⁃177 研究表明，MSI⁃H/dMMR 患者姑息一线应用帕博利珠单抗，客观缓解率为43.8%，而标准化疗靶向组显著较低，为33.1%。MSI/MMR状态对于遗传性结直肠癌的诊断也具有较大的意义，尤其是林奇综合征的诊断，MMR基因的胚系突变是确诊的金标准。因此，对于临床考虑遗传性结直肠癌的患者，应推荐常规进行MSI/MMR状态以帮助诊断；而对于其他结直肠癌患者，完善MSI/MMR状态的检测可为后续治疗选择提供参考依据。
专家意见1：对于所有mCRC患者，均推荐在综合治疗前行常规分子标志物检测（RAS基因突变、BRAF基因突变、MSI状态/MMR蛋白表达），根据结果制定个体化治疗方案；推荐对于所有临床怀疑林奇综合征的患者，检测MSI状态/MMR蛋白表达进行遗传筛查。
二、其他分子标志物检测
除上述常用分子标志物外，目前，其他潜在的分子标志物在结直肠癌中的发生率低，临床意义及靶向治疗的反应性尚在评价中，如Her⁃2扩增/过表达、PIK3CA突变、NTRK融合和肿瘤突变负荷（TMB）。
1. Her⁃2
Her⁃2是EGFR基因家族成员，其作为结直肠癌的原癌基因之一，可通过激RAS⁃RAF⁃MEK和PI3K⁃AKT⁃mTOR 通路，抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤新生血管形成。结直肠癌中Her⁃2扩增/过表达的总体发生率约为5%，与KRAS、NRAS和BRAF突变存在相互排斥，且在原发肿瘤与转移瘤之间高度一致。推荐对于经标准治疗失败后的mCRC患者可进行Her⁃2扩增/过表达的检测。目前，结直肠癌Her⁃2的检测方法和判断标准均来自临床研究方案，尚未建立经过权威机构认证的、作为伴随诊断的检测流程和判读标准。NCCN指南和CSCO指南目前均推荐Her⁃2扩增/过表达患者可接受抗Her⁃2靶向药物的治疗，两个指南的差别在于CSCO指南推荐在姑息三线及三线治疗以后使用，而NCCN指南则对姑息一线、不能耐受高强度治疗的患者也有抗Her⁃2治疗的推荐。
2. NTRK基因融合
NTRK基因融合在结直肠癌中比较罕见，发生率为0.35%。NTRK抑制剂仅对携带NTRK融合的患者有效，而对突变患者无效。IHC是一种有效，快速的初筛方法，IHC阳性的肿瘤需使用FISH、PCR或NGS方法进一步
验证。由于NTRK基因融合发生率极低，目前仅推荐在标准治疗失败后、或者筛选临床研究的患者中进行检测。
3. PIK3CA 突变
在中国人群中 PIK3CA 突变率仅为3.5%，与RAS信号通路共同构成EGFR下游两条平行通路。与 RAS 和 BRAF 基因突变的排他性不同，PIK3CA 突变可与RAS 突变共同存在。根据部分已有的研究结果，PIK3CA 突变可能是对阿司匹林治疗有效的预测标志物，但各研究之间尚缺乏较好的一致性。此外，由于PIK3CA突变与抗EGFR单抗疗效的相关性目前尚不能完全确定，因此，目前尚不推荐对结直肠癌患者常规行PIK3CA突变检测。
4.TMB
TMB是肿瘤组织DNA中基因组突变数的指数，它是测量肿瘤体细胞内编码蛋白的平均1Mb范围内的碱基突变数量，包括基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失等各种形式的突变。FDA于2020年6月批准了免疫检查点抑制剂用于治疗高肿瘤突变负荷（TMB⁃H≥10个突变/兆碱基）的无法切除或转移性实体瘤的成年和儿童患者。目前在结直肠癌中尚不推荐常规行TMB检测。
专家意见2：对于经标准治疗失败的mCRC患者，可进行Her⁃2扩增/过表达和NTRK基因融合的检测；PIK3CA突变检测和TMB检测仅限研究使用。
三、遗传易感性基因检测
对结直肠癌的遗传易感性基因的检测需要在胚系细胞中检测才能明确。严格意义的胚系细胞是指精子和卵子。考虑到样本采集的便利性，临床上常用外周血淋巴细胞或口腔黏膜细胞代替。在结直肠肿瘤中发现的突变如果在外周血淋巴细胞或口腔黏膜细胞中得到证实，就可推定患者所有细胞都携带有该突变，可以认为是胚系突变。与结直肠癌遗传易感性相关的基因包括APC、MMR和STK⁃11等基因。
其中，APC 基因的突变和家族性腺瘤性息肉病（FAP）有关，其基因型和临床表型存在相关性，即碱基突变的位置和息肉发生的严重程度有关。如怀疑 FAP 而 APC 基因无突变者，还需要进一步检测MUTYH基因突变。遗传性非息肉病性结直肠癌（林奇综合症）是一种常染色体显性遗传性疾病，其发病与 MMR 基因的胚系突变有关。MLH1、MSH2、MSH6 和 PMS2 是最常见发生突变的 4 个 MMR。大约 70% 的林奇综合征患者是由 MSH2 和 MLH1 突变所致，其余 30% 多由 MSH6 和 PMS2突变所致。
专家意见 3：对于临床上怀疑诊断家族性息肉病、林奇综合征和P⁃J综合征等家族遗传性疾病者，推荐行相关遗传易感性基因的胚系突变检测。
四、结直肠癌相关蛋白表达检测
IHC检测是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。IHC检测是肿瘤诊疗中的重要工具，对判定肿瘤来源、类型、恶性程度、耐药和预后都提供了重要价值。本文主要描述了与结直肠癌鉴别诊断/辅助诊断有关的IHC 标志物，包含但不仅限于如下标志物。
专家意见 4：对于结直肠癌患者，推荐对经手术切除或活检的原发灶或转移灶组织标本行相关分子标志物的蛋白表达水平检测，以帮助判定肿瘤来源和类型。
与结直肠癌鉴别诊断/辅助诊断有关的免疫组织化学（IHC）标志物
引用资料：
1. 中国抗癌协会肿瘤靶向治疗专业委员会 《结直肠癌分子检测高通量测序中国专家共识》：临床肿瘤学杂志 2021 年 3 月第 26 卷第 3 期 Chinese Clinical Oncology，Mar． 2021，Vol．26，No．3
2. 中国临床肿瘤学会（CSCO）结直肠癌专家委员会. 结直肠癌分子标志物临床检测中国专家共识 [J] . 中华胃肠外科杂志, 2021, 24(3) : 191-197. DOI: 10.3760/cma.j.cn.441530-20201225-00679.