在过去数十年中，RNA的生物学角色发生了深刻的变化。最初，RNA被认为只是介于DNA与蛋白质之间的中间信息载体，但现代研究已经揭示RNA的功能远超简单的遗传信息传递。尤其是环状RNA（circular RNA, circRNA）的发现，极大地扩展了我们对RNA生物学的理解。这些RNA分子通过独特的剪接机制形成闭合环状结构，类似分子折纸，使其在生物学功能上区别于传统的线性RNA。环状RNA最初被视为异常剪接的产物，但随着研究的深入，它们被证实广泛存在于各种生物体中，并在癌症、心血管疾病和阿尔茨海默症等多种病理过程中起到重要作用。此外，环状RNA的稳定性和调控能力也使其具备成为潜在治疗剂和生物标志物的应用前景。环状RNA的形成源于一种独特的反向剪接机制，这种机制与传统的前体mRNA剪接完全不同，后者是通过内含子剪接和外显子拼接形成的线性mRNA。反向剪接使得外显子3′末端反向连接至上游外显子的5′末端，从而形成环状结构。这种独特的结构不仅使得环状RNA具有非线性特性，还赋予了它们多种功能。环状RNA被发现不仅可以在细胞内充当调控因子，还能够通过与多种RNA结合蛋白（RBP）和其他RNA分子相互作用，在基因表达调控、细胞分化、以及疾病发生中扮演重要角色。（11月11日Nature “Circular logic: understanding RNA’s strangest form yet”）
环状RNA的生物学功能
尽管环状RNA在细胞中相对稀少，仅占非核糖体RNA的约0.1%，其功能丰富多样，展现了对细胞过程的广泛影响。环状RNA的形成涉及特殊的反向剪接事件（back-splice junction），这一特性使其在结构上与线性RNA显著不同。环状RNA的独特结构赋予了其多样的功能，主要包括：
与microRNA相互作用：环状RNA可以作为microRNA的“海绵”，与之结合，从而调控microRNA对靶mRNA的抑制作用。这种机制被称为“microRNA海绵效应”，能够通过吸附microRNA来减少其活性，从而间接增加下游基因的表达。例如，环状RNA Cdr1as能够与miR-7结合，调控神经元中神经递质谷氨酸的释放，进而影响神经功能。研究表明，Cdr1as能够结合超过70个miR-7结合位点，从而起到对miR-7的有效吸附，这种强效的吸附功能使Cdr1as在神经系统中起到至关重要的调控作用。与RNA结合蛋白（RNA Binding Protein, RBP）相互作用：环状RNA能够通过与RNA结合蛋白结合，调节其活性，或者作为蛋白质相互作用的支架。具体来说，某些环状RNA可以通过作为增强子或支架来促进蛋白质之间的相互作用，从而影响信号转导和基因表达调控。例如，研究发现环状RNA circ-Foxo3可以与细胞周期调控蛋白结合，抑制细胞周期的进展，从而对细胞增殖起到负调控作用。此外，circZKSCAN1也被发现通过与RBPs相互作用，抑制肝癌细胞的转移和侵袭能力，表明环状RNA在癌症的发生和进展中具有关键作用。编码功能性小肽：尽管多数环状RNA不具备编码能力，但在特定条件下，它们可被翻译为具有生物学功能的小肽。2023年的研究表明，一些环状RNA能够在细胞中翻译为功能性小肽，这些小肽在细胞生理过程中发挥重要作用。例如，研究者发现circ-SHPRH能够编码一种小肽，称为SHPRH-146aa，该小肽在胶质瘤中能够抑制细胞的恶性增殖。此外，circFBXW7也被发现编码一种与细胞周期调控有关的小肽FBXW7-185aa，这些小肽的发现揭示了环状RNA在癌症和其他疾病中潜在的治疗作用。基因表达调控：环状RNA还能够直接与DNA结合，从而影响基因的转录。某些环状RNA通过与基因组特定位点结合，可能促进基因重排，这一机制在白血病等癌症的发展过程中具有重要意义。例如，环状RNA circSMARCA5被发现可以结合到特定的基因启动子区域，从而调控该基因的转录活性。这些环状RNA在染色质重塑、基因表达调控和细胞命运决定等方面都具有重要的生物学作用。（Credit: V. M. Conn et al. Nature Rev. Cancer 24, 597–613 (2024)）
环状RNA的检测与挑战
环状RNA的低丰度和与线性RNA的相似性使得其检测面临诸多挑战。环状RNA的唯一特征是其独特的环状结构，这一特性使得对其进行区分和检测十分困难。通常的RNA测序方法往往忽略了环状RNA，因为标准RNA文库的构建依赖于mRNA的poly(A)尾巴，而环状RNA缺乏这一特征。
为了有效识别环状RNA，研究人员专注于寻找“反向剪接点”，即RNA链3′末端与上游5′末端相连接的位置。这一剪接模式的多样性和内含子的存在增加了检测的复杂性。为了克服这些困难，研究者们开发了多种特异性工具，例如CirComPara2和circtools，用于提高检测的准确性和可靠性。在2023年对16种不同工具的比较中，发现相同细胞系中检测到的环状RNA数量从1372个到58032个不等，显示了不同算法在灵敏度和特异性上的显著差异。此外，常用的验证方法包括定量PCR（qPCR）和Northern blotting，这些方法可以帮助确认环状RNA的真实存在性和特异性。
另一种有效检测环状RNA的方法是通过去除线性RNA。RNase R是一种常用的外切酶，能够降解线性RNA而不影响环状RNA，从而富集环状RNA用于后续的分析。然而，由于某些线性RNA具有复杂的二级结构，例如G-四联体，它们可能对RNase R具有抵抗性，因此在实验设计中必须谨慎控制酶的浓度和反应条件。此外，环状RNA的高效检测还依赖于高通量测序技术的发展，如Illumina短读长测序和PacBio长读长测序，这些技术使得环状RNA的全面鉴定和定量成为可能。
环状RNA的功能验证与机制研究
环状RNA的功能研究是其生物学意义探索中的关键环节。研究者们采用了多种方法来验证这些分子的功能，包括基因敲低和过表达实验。例如，RNA干扰（RNAi）技术可以靶向环状RNA的反向剪接点，以降低其表达，从而研究其在特定生理或病理状态下的作用。
近年来，CRISPR-Cas系统也被应用于环状RNA的研究中。通过使用Cas13酶靶向环状RNA的特定位点，研究人员能够高效地敲低环状RNA而不影响基因组的其他部分。这种方法的敲低效率通常在80-90%之间，显著高于传统的RNA干扰方法。CRISPR-Cas13系统具有高特异性，能够靶向RNA水平而不引起基因组的永久性改变，这使其成为研究环状RNA功能的强大工具。此外，使用CRISPR-Cas9靶向环状RNA的基因座也能够间接研究其功能，通过破坏基因组中的环状RNA形成区域，可以观察环状RNA缺失对细胞或有机体的影响。
环状RNA的功能验证还依赖于细胞和动物模型的构建。例如，通过将环状RNA在特定细胞系中过表达，研究者可以评估其对细胞增殖、凋亡、迁移等生物学过程的影响。此外，利用小鼠模型进行体内研究，可以揭示环状RNA在生理和病理条件下的具体功能。Rajewsky团队最近采用化学和电刺激、单细胞RNA成像以及microRNA敲除等多种技术手段，研究了环状RNA Cdr1as在神经元中的作用，发现其与miR-7的相互作用在神经递质释放中起到了关键作用。
环状RNA的应用前景：从基础研究到临床应用
环状RNA的独特结构与功能使其在医学领域展现出广泛的应用前景。首先，环状RNA作为生物标志物具有巨大的潜力。由于其在细胞内的相对稳定性，以及在特定疾病状态下的显著表达变化，环状RNA可用于疾病的早期诊断和预后评估。例如，某些癌症患者血液中的环状RNA水平显著升高，这为无创癌症诊断提供了新的可能性。此外，环状RNA在心血管疾病、神经退行性疾病等多种疾病中的差异性表达，使其有望成为广谱的诊断和预后标志物。
其次，环状RNA还可以作为治疗靶点或治疗剂。通过靶向特定的环状RNA，可以有效调控其相互作用的microRNA或蛋白质，进而影响下游的信号通路和基因表达。例如，通过靶向环状RNA Cdr1as，可以调控miR-7的活性，从而在神经系统中产生重要的治疗效果。此外，环状RNA也可通过体外合成并导入体内，作为治疗剂直接发挥作用。环状RNA的稳定性使其在细胞中不易被降解，从而成为药物开发的理想分子基础。目前，已有研究利用体外合成的环状RNA成功调控免疫反应和抗癌活性，这为环状RNA作为核酸药物的开发提供了理论依据。
环状RNA的应用还包括基因编辑领域。通过将环状RNA与CRISPR系统结合，研究人员可以设计出特异性更强的基因编辑工具，用于纠正遗传缺陷或靶向癌细胞。此外，环状RNA的生物学功能使其在细胞治疗中也具有广阔的应用前景。例如，利用环状RNA作为基因表达的调控开关，可以提高CAR-T细胞疗法的特异性和有效性，从而降低副作用，提升治疗效果。
环状RNA研究的未来
环状RNA的研究正在迅速发展，并展示出广泛的生物学功能及巨大的医学应用前景。随着检测技术和功能研究方法的不断进步，我们有望揭示更多环状RNA在细胞和疾病中的作用，并将其应用于临床诊断和治疗。然而，正如Rajewsky所言：“关于这些神奇的分子，还有很多值得探索的地方。”对于科学界而言，这既是挑战，也是前所未有的机遇。环状RNA的研究不仅扩展了我们对RNA分子多样性和复杂性的认识，也加深了我们对生命基本过程的理解。
总的来说，环状RNA的发现和研究为现代生命科学注入了新的活力，揭示了基因调控的全新层面，并为复杂疾病的研究提供了独特的视角。通过进一步的基础研究和临床应用探索，我们相信环状RNA将在未来的生物医学研究中占据重要位置，成为攻克重大疾病、提升人类健康水平的重要工具。
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