导读
前段时间，我们实验室一项历时14年的科研成果得以发表，文章以骨肉瘤miR-1246为例，揭示了AGO2调控NamiRNA与增强子相互作用激活基因转录的分子机制。遥想过去，一路坎坷波折，借诺奖东风，我们将重点回顾NamiRNA相关研究科学进展，梳理大家经常提出的问题并逐个解答，凝练NamiRNA领域重要科学问题，诚邀感兴趣的科研工作者共同参与NamiRNA研究，让沉默的miRNA活跃起来，共同见证NamiRNA成长和发展，开启miRNA研究下半场！
1. miRNA研究快速发展，miRNA基因调控理论亟需更新
miRNA是一类内源性表达的短链非编码RNA（Non-coding RNA, ncRNA），其长度通常在19 ~ 23 nt[1]。1993年，哈佛大学Victor Ambros教授团队在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）中发现首个miRNA——lin-4[2]，其能通过结合靶基因lin-14转录本mRNA的3'非编码区域（Untranslated region，UTR）抑制其表达，开启miRNA研究大门。2000年，Gary Ruvkun团队在线虫中发现第二个miRNA——let-7，随后miRNA研究逐渐兴起。截止2024年11月8日，PubMed检索“miRNA”发文量已超过17万篇（图1），探究了miRNA在个体发育以及不同疾病进程中的重要作用，在miRNA产生过程、生物功能、调控基因模式等方面都取得很大进展，提示miRNA研究已经进入快速发展的时代。
图1. PubMed 中miRNA相关文献检索
其中，miRNA生物合成过程研究相对清晰[3]：如图2，在细胞核中，RNA聚合酶从基因组转录产生初级miRNA转录本（Primary miRNA，Pri-miRNA），由5'及3'侧翼序列以及发卡结构组成；接着，DGCR8和Drosha组成的微处理器将Pri-miRNA的侧翼序列剪切，形成前体miRNA（Precursor miRNA，Pre-miRNA），含有5'磷酸基团和3'羟基；随后，输出蛋白5（Exportin 5，Exp5）结合Pre-miRNA将其转运出细胞核。在细胞质中，DICER与TRBP共同作用切割Pre-miRNA的颈环形成miRNA复合中间体，成熟的miRNA装载与AGO蛋白及其他蛋白组装成miRNA介导的沉默复合体（miRNA-induced silencing complex，miRISC），发挥下游功能。
图2. miRNA生物合成过程[3]
说到miRNA的作用机制，人们立刻想到miRNA能够抑制基因表达[3]：miRNA能够与靶基因mRNA的UTR区域相结合，通过诱导其降解或者抑制其翻译在转录后水平降低目的基因表达。如图3，miRNA与AGO形成miRISC，其第2到8个核苷酸的种子序列（Seed Sequence）主要通过不完全碱基互补配对原则识别靶标mRNA的3'UTR区域；AGO蛋白通过结合GW蛋白家族（如TNRC6）的色氨酸残基（红色W）将其招募，TNRC6蛋白沉默结构域（Silencing domain，SD）中色氨酸残基W则与脱腺苷酸酶复合体CCR4–NOT和PARN2–PARN3结合，导致靶标mRNA去腺苷酸化，Ploy (A)的截断会诱导脱毛酶复合体DCP1-DCP2及DDX6等其他蛋白结合在mRNA的5'端移除m7G帽子，进一步促进其降解。此外，DDX6通过抑制负责翻译起始eIF4F复合体的组装或者活性参与miRNA介导的翻译抑制，但具体机制尚待进一步阐明。
图3. miRNA抑制基因表达作用模式图[3]
目前，经典的miRNA抑制理论引导着前赴后继的科研工作者探究miRNA调控不同疾病及发育进程的作用机制，但逐渐形成“miRNA-X通过抑制X基因诱发X疾病”的研究套路。仔细想想，这一惯用的“研究套路”似乎已经禁锢研究者的思维方式，使我们在研究miRNA作用机制时大多关注miRNA靶向下调基因，但对miRNA过表达后上调的基因视而不见，默认其作用比较微弱，或者对于怎样开展后续研究一筹莫展。事实上，这里有两个关键的问题：（1）miRNA是否能够直接激活基因表达呢？（2）miRNA是如何激活基因表达？
2. 打破禁锢，NamiRNA-增强子-基因激活理论应运而生
我们实验室（复旦大学于文强教授课题组）自2009年起致力于核内miRNA激活研究，研究初期，我们通过UCSC Genome Browser定位miRNA在基因组上的位置信息，同时标注相应基因组上的组蛋白修饰信息，发现特别有意思的现象：大部分miRNA的位置上存在H3K27ac或者H3K4me1修饰。换句话说，miRNA与增强子是高度重叠的，提示miRNA可能与增强子功能具有相关性。考虑到增强子调控基因激活的作用，我们大胆假设：miRNA本身具有激活基因的潜能。那么，如何选择miRNA激活的潜在靶基因呢？增强子不仅可以激活远端基因，也可以上调临近基因。于是，我们就选择了miR-26A-1、miR-339、miR-24-1等miRNAs并构建了相应的表达载体，如图4，过表达miR-26A-1和miR-339分别促进VILL以及GPER等临近基因表达升高[4]。因此，miRNA的确具有基因激活的作用，但是通过怎样的机制促进基因表达呢？
图4. miRNAs激活临近基因表达
图5. miR-24-1导致Pol II、P300和H3K27ac显著富集
鉴于miRNA与增强子的重叠以及RNA聚合酶II（RNA polymerase II，Pol II）在转录中的重要作用，我们通过ChIP实验检测了Pol II、P300和H3K27ac在miRNA所在基因组区域的富集程度。如图5，过表达miR-24-1导致Pol II、P300和H3K27ac在miR-24-1所在区域显著富集，提示miRNA通过招募组蛋白修饰酶（如P300）改变增强子的活性促进其靶基因的转录激活。此外，RNA-seq显示HEK293T细胞中过表达miR-24-1上调基因与下调基因比例相当（图5A），ChIP-seq分析显示miR-24-1靶向增强子比例高达60%。因此，位于增强子的miRNA能够通过靶向激活增强子活性在转录组水平全局上调基因表达。
图6. HEK293T细胞中过表达miR-24-1后RNA-seq及ChIP-seq分析
在此基础上，我们将位于细胞核内能够与增强子结合并激活基因转录的miRNA命名为核内激活miRNA（Nuclear Activating miRNA，NamiRNA）[5]。随后，我们进一步提出NamiRNA-增强子-基因激活理论（图7）：位于细胞核内的miRNA发挥点火器的作用，一方面活化本身所在增强子，激活临近基因表达，另一方面活化miRNA靶向增强子，激活远端基因表达，其激活作用需要Pol II、AGO2以及Mediators的参与，但仍需进一步探索不同蛋白因子在NamiRNA-增强子-基因激活中的具体作用和分子机制。
图7. NamiRNA-增强子-基因激活模式图
3. 日积月累，NamiRNA研究蓬勃发展但机制研究遇阻碍
2008年底，于文强教授加入复旦大学，将miRNA研究作为课题组重要的研究方向之一，随后开始招生并组建科研团队，经过多次投稿辗转最终在2015年时被RNA Biology接收并发表[4]（图8）。在本文中，我们发现位于细胞核内的NamiRNA能够通过与增强子相互作用导致基因的转录激活，同时增加增强子RNA（Enhancer RNA，eRNA）转录，促进P300和RNA聚合酶II在增强子的富集。因此，miRNA作为增强子激活剂通过表观调控促进基因转录。
图8. NamiRNA研究开山之作
图9. NamiRNA、增强子与基因激活关系模式图
随后，我们提出NamiRNA与增强子激活基因的原始模式（图9）[5]：NamiRNA与增强子相互作用促进H3K27ac等富集活化增强子，而增强子则转录生成更多NamiRNA实现自我活化；NamiRNA使P300、RNA聚合酶II等在增强子显著富集，增强子与基因启动子相互作用激活基因转录成mRNA。
图10. miR-339低表达通过增强子互换抑制抑癌基因GPER1表达
2021年，我们团队联合北京中科院生态中心汪海林团队、复旦大学附属肿瘤医院李大强团队，揭示了乳腺癌中miR-339表达缺失是抑癌基因沉默的关键而非DNA甲基化（图10），而miR-339可以通过增强子互换激活GPER1等抑癌基因的表达，为三阴性乳腺癌的治疗提供全新的思路，相关研究发表在Nucleic Acids Research杂志[6]。
2022年，基于NamiRNA-增强子-基因激活理论，我们发现新冠病毒中存在与人相同的短核苷酸序列并命名为人也序列（Human Identical Sequences, HIS），其能靶向增强子激活透明质酸合成酶HAS2表达，诱导新冠患者体内透明质酸的积累，进而诱发相应临床症状，而靶向抑制透明质酸合成则能显著改善新冠症状，相关研究分别发表在柳叶刀旗下子刊EBioMedicine[7]和Nature旗下子刊Signal Transduction and Targeted Therapy[8]。
2024年，我们以骨肉瘤为研究对象，以miR-1246为代表，探究了AGO2在NamiRNA靶向激活基因中的调控机制[9]。如图11，恶性骨肉瘤通过外泌体将miR-1246转运至良性骨肉瘤细胞内，AGO2保障miR-1246靶向增强子激活MMP1进而促进细胞迁移。具体来说，AGO2能够识别miR-1246与靶向增强子DNA形成的复合体结构，阻止细胞内RNase H降解复合体中miRNA，维持DNA双链的打开状态，保障MMP1基因转录生成mRNA。因此，AGO2在NamiRNA-增强子基因激活中起着安全卫士的重要作用。此外，我们发现AGO2与P300同时富集在MMP1增强子区域，考虑到AGO2能够与P300直接作用[10]，AGO2还可能直接招募P300介导H3K27ac修饰增加活化增强子，进而激活基因转录。
图11. AGO2保障miR-1246靶向激活MMP1调控骨肉瘤转移
不可否认，NamiRNA-增强子-基因激活理论的研究和实践还有很长的路要走，但我们始终坚信，NamiRNA研究必将一点一滴不断积累，逐渐引导科研工作者探究NamiRNA在不同疾病及个体发育进程中的作用机制，不断完善NamiRNA激活基因的理论体系和分子机制。
目前，我们实验室仍在继续NamiRNA相关研究，探究它们在肝癌、肺癌等肿瘤以及艾滋病毒等传染病中的作用及致病机制，希望为相关疾病的治疗提供新的靶点和策略。另外，我们团队也在积极与中科院、首都医科大学、沈阳药科大学等科研团队积极合作，共同推动NamiRNA研究进展。此外，我们在复旦大学的大力支持下，已筹办四届《国际表观基因组学研讨会》和两次《核内miRNA激活讲习班》，助力NamiRNA研究领域的兴起。事实上，除了我们团队外，其他科研团队也在紧跟NamiRNA研究，相信这一领域会越来越活跃，不断壮大！
4. NamiRNA激活理论对基础和临床研究具有重要指导意义
科学理论的价值在于指导实践，而实践是检验真理的唯一标准。NamiRNA-增强子-基因激活理论的建立对于miRNA的基础研究和临床应用具有重要意义：
（1）打破传统miRNA抑制理论，为从事基础研究的科研工作者提供新视角探究miRNA在不同疾病和个体发育中的作用机制，不仅能阐明全新基因调控模式，而且可能发现新的关键致病因子，为疾病治疗提供新的靶点。
（2）改变传统的临床治疗潜能miRNA筛选标准，聚焦NamiRNA对基因组全局水平的激活作用，从正向调控角度锁定在不同疾病中起重要作用的miRNA，有望打破30年来miRNA靶向药物尚无临床应用的僵局。
事实上，我们团队自提出NamiRNA靶向增强子激活基因表达的全新理论，就开始在不同疾病及发育模型中验证，逐步推进其作用机制研究，但也曾遇到很多质疑。鉴于NamiRNA研究论文的投稿经历以及演讲经历，我们精心梳理了审稿人及不同听众对NamiRNA研究的疑惑之处，希望借此机会从我们的理解为大家解答疑惑，和大家共同努力推动NamiRNA的基础和临床应用研究。
Q1. NamiRNA与传统miRNA有什么不一样？
NamiRNA与传统miRNA不仅紧密相连，而且各具特色。具体来说，NamiRNA与传统miRNA的序列是一致的，但其细胞定位及调控基因的功能则不相同。基于经典miRNA抑制理论，传统miRNA指的是位于细胞质中通过与mRNA非编码区域结合在转录后水平抑制基因表达的miRNA。然而，NamiRNA是位于细胞核内通过与增强子相互作用在转录水平激活基因表达的miRNA，其所在基因组位置与增强子标志物H3K4me1或H3K27ac高度重叠，即NamiRNA位于增强子。此外，我们发现超过1200条miRNA与增强子重叠[11]，提示绝大多数miRNA可能作为NamiRNA发挥基因激活的功能。
Q2. miRNA如何进入到细胞核发挥激活作用？
在真核细胞中，核膜是将细胞质和细胞核分开的双层膜结构，控制细胞核内外物质运输。人们通常认为，miRNA在细胞核转录生成pri-miRNA并被加工成pre-miRNA，随后被转运至细胞质加工成为mature-miRNA，那么miRNA是怎么进入细胞核呢？基于文献调研，我们推测miRNA进入细胞核的途径至少有2种：（1）miRNA的3'端存在特定短核苷酸序列引导miRNA入核。例如，miR-29b具有一段类似于核定位信号的序列（AGNGUN，N指任意核苷酸）[12]，使其显著富集在细胞核内。（2）核膜在细胞周期中会出现消失后重建的动态过程，细胞质与细胞核中的物质更易发生交换，miRNA则能进入细胞核中。另外，考虑到生物体对能量的高效利用，我们推测细胞核内可能存在某种途径介导pre-miRNA成熟，无需经历运出细胞核再被运进细胞核的过程。然而，我们仍需进一步研究阐明miRNA进入细胞核的具体分子机制。
Q3. AGO2在NamiRNA激活基因中功能是什么？
在四种人AGO蛋白中，AGO2是唯一具有RNase H活性的蛋白，在NamiRNA激活基因中主要发挥两个方面的作用。一方面，AGO2依赖自身PAZ结构域识别NamiRNA-增强子DNA杂交体，保护其中miRNA不被RNase H降解，维持NamiRNA-Enhancer结合稳定性，使DNA双链处于打开状态，促进NamiRNA介导的基因转录激活。另一方面，AGO2可能作为锚定蛋白，招募P300等组蛋白修饰因子聚集在NamiRNA-Enhancer结合区域，导致H3K27ac等组蛋白修饰富集进而活化增强子，进而与转录因子、RNA聚合酶等相互作用促进基因转录。换句话说，NamiRNA激活基因转录是以AGO2与NamiRNA-Enhancer结合为核心，由多种表观遗传调控蛋白、转录因子及RNA聚合酶等共同参与的复杂过程。
Q4. 如何确定NamiRNA靶向调控的潜在基因？
我们通常从多个维度确认NamiRNA靶向调控的潜在基因。首先，基于NamiRNA-增强子-基因激活网络，我们可以通过生物信息学方法预测NamiRNA靶向调控的潜在增强子，再检索增强子上下游基因初步筛选为NamiRNA调控的潜在靶基因。其次，我们通过在细胞中过表达或敲除NamiRNA并进行转录组测序，通过差异表达基因分析及RT-qPCR等方法验证NamiRNA对靶基因的调控。同时，我们开展ChIP-seq分析增强子的变化进而确认NamiRNA调控增强子，通过ChIP-qPCR以及荧光素酶报告实验验证NamiRNA与增强子的相互作用。最后，我们可以利用CRISPR/Cas9技术敲除增强子部分序列进而破坏增强子的完整性验证NamiRNA对靶基因的激活情况。
Q5. NamiRNA激活基因转录的具体机制是什么？
NamiRNA可以在全基因组水平激活基因转录，其本质在于打开DNA双链，在AGO2帮助下维持单链状态，增强RNA聚合酶II的结合及对靶基因的转录，从而在转录水平促进基因表达。前期研究发现[4, 6]，敲减AGO2显著抑制不同NamiRNA对靶基因的激活，提示NamiRNA靶向基因激活依赖于AGO2蛋白。我们的最新研究发现[9]，AGO2能够通过PAZ结构域感知和识别NamiRNA与增强子形成的杂交链结构，避免胞内RNase H破坏NamiRNA与增强子的结合，使DNA双链处于打开状态，有利于后续基因转录的进行。此外，在NamiRNA激活基因过程中，我们发现AGO2与P300、RNA聚合酶II等在基因组相同区域都有显著富集，但这些蛋白如何精准且巧妙地协调完成NamiRNA介导的基因激活以及是否有其他蛋白参与NamiRNA激活基因进程仍需要深入探究，以期揭示更详细的分子机制。
NamiRNA的发现已经开启miRNA研究2.0时代。近期，我们团队将筹办《核内miRNA激活讲习班》，面向全国招生，旨在汇聚想从事miRNA激活功能研究的老师和同学。
我们坚信，作为科研工作者，我们要敢为人先，打破原有miRNA负向调控理论的束缚，尝试NamiRNA-增强子-基因激活理论，正视miRNA在个体发育及疾病进程中的重要作用，从新视角探究miRNA调控基因的新模式，逐步完善NamiRNA靶向增强子激活基因的分子机制，努力解决基础和临床研究中的重要科学问题。
石中花（Pixabay）
回顾了近十几年的科学研究，心中可谓五味杂陈，不禁要问自己，我们从中到底学到了什么？首先，原创科研成果并非一蹴而就，需要更多时间积淀，在探索阶段必然遇到各种难题，需要投入更多人员和资金支持，还要能够经得起检验。其次，科研工作者倾向于接受自己所熟悉的知识体系，易受现行理论框架约束，很难接受并尝试新的理论体系，这意味着原创成果在投稿时很难，后期推广更是难上加难。
最后，“真问题”是基础和临床研究中要解决的核心问题，只有真正理解这些问题的重要意义，即使历经磨难，我们仍能满心期待，全力以赴，享受科研生活的乐趣，结出理想的果实！总的来说，原创性科研工作是真的很难，但只要能解决“真问题”就值得我们坚定不移地走下去。