【第四届检验与临床（自免与过敏）案例展示全国决赛稿件】
作者 | 娄璨1，李佳明1，刘萌2，蔡晓红1
单位 | 上海交通大学医学院附属瑞金医院1.临床输血科，2.重症医学科
（汇报人：娄璨，邱毓祯）
患者，女，59岁，2年前行肠镜检查发现直肠息肉，于外院行直肠息肉切除术，半年后复查未见异常。2023-06-29于外院行肠镜检查示：“距肛缘15-12厘米直肠黏膜可见溃疡形成，周围黏膜不规则隆起，肠腔狭窄”，病理诊断为“直肠腺癌”，后于我院门诊就诊。
现患者为求进一步诊治，以“直肠恶性肿瘤”收治入院。入院第二天，接受了腹腔镜下直肠乙状结肠部分切除术（L-Dixon）。术中发现，直肠约离肛门口10厘米处有一个肿瘤，表现为局部浸润到浆膜并延伸到阴道壁。
手术团队成功地完成了完整的肿瘤切除，并通过端端吻合连接远端结肠和直肠。手术后病理分析将肿瘤分期为pT4N2M0，并确认了清晰的边缘，表明进行了完整（R0）切除。
如前所述，患者在接受L-Dixon术后情况稳定，中间陆续服用抗生素进行抗感染。术后第41天，第4次静脉滴注头孢噻肟中，患者出现皮疹、瘙痒和呼吸困难，遂迅速停止了头孢噻肟的输注。
立刻实验室检查显示白细胞计数增高（WBC，27.42×10^9/L，中性粒细胞占87.3%），血红蛋白降低（Hb61 g/L），血小板计数正常（PLT138×10^9/L）。考虑到血红蛋白下降和潜在出血的担忧，当晚进行了紧急的腹腔探查手术，发现腹腔内有中等量的暗红色血性腹水，无明显的脓液或类似粪便的物质。
第42天，患者白细胞进一步升高，Hb和PLT计数进一步下降，凝血功能测试表明凝血功能异常，激活部分凝血活酶时间（APTT，72.3秒；正常参考值22.3-38.7秒）和凝血酶原时间（PT，46.0秒；正常参考值10.0-16.0秒）均延长。
纤维蛋白原（Fg）水平低至0.5g/L，纤维蛋白降解产物（FDP，120mg/L；正常参考值0-5mg/L）和D-二聚体水平（40mg/L；正常参考值0-0.55mg/L）升高，提示凝血功能显著受损。
同时患者的血红蛋白水平急剧下降至53g/L，并伴有深色的、酱油色的尿液。与此同时，胆红素-特别是未结合的胆红素-丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）水平显著升高。患者的血浆（或血清）反映了酱油的深色，外周血涂片显示有大量的裂细胞，表明溶血活跃。
腹部CT扫描发现手术部位周围有液体堆积。无论是病原微生物的下一代测序（NGS）还是第42天的血液培养均未产生阳性结果，因此排除了感染。
结合患者临床表现和实验室检查，考虑诊断为：由头孢噻肟引起的免疫性溶血性贫血。
患者大量的实验室检查结果包括血红蛋白、胆红素以及血涂片等显示患者出现了较为严重的溶血症状（图1和表1），那么我们首先采用了根据AABB的指南我们使用直接抗球蛋白试验（DAT）评估了血样，并发现EDTA抗凝剂处理的患者样本呈阳性结果。进一步分析发现DAT中存在C3补体，但未检测到IgG抗体。
图1 患者血涂片
表1 患者最后一次头孢唑肟使用前后详细实验室检查结果对比
为了评估头孢噻肟与红细胞之间的相互作用是否能模拟治疗药物水平，然而，当我们进行间接抗球蛋白试验（IAT）时结果为阴性。随后我们评估了接受头孢噻肟治疗的患者血清中药物依赖性抗体的存在。这一多步骤的测试过程使我们能够密切检查与头孢噻肟相关的免疫反应，并与溶血反应进行对比[1]。
我们准备了450μLO型红细胞悬浮液，并与50μL头孢噻肟溶液混合（0.5g药物溶解在50mL生理盐水中），使最终浓度达到1mg/mL。该混合物在37°C下孵育30分钟，随后用生理盐水洗涤三次，以确保去除未结合的药物分子。随后，将100μL患者血清与处理过的红细胞悬浮液的50μL混合，立即离心（表2）。
表2 患者血清、药物和O红细胞进行的凝集反应
这一步骤未导致红细胞凝集。然而，在120μL患者血清和60μLO型红细胞的混合物中加入20μL可溶性头孢噻肟，离心后出现明显的凝集。为了验证我们的发现，我们进行了两个对照实验：一个是将患者血清与O型红细胞混合，另一个是将AB型血液供体血清（缺乏抗体）与O型红细胞和头孢噻肟混合。在两个对照组中，即使在加入新鲜补体或使用患者的新鲜血清后，也没有发生溶血。
基于这些观察结果，我们得出结论：头孢噻肟诱导的抗体可在可溶性药物存在的情况下导致红细胞凝集，表明头孢噻肟依赖性DIIHA的机制是通过免疫复合物介导的。
为了去除IgM抗体，我们将患者血清与巯基乙醇在37°C下处理30分钟后，与头孢噻肟和O型红细胞混合使用OrthoAnti-IgG，-C3d；多特异性凝胶卡仍保持凝集反应。这表明存在IgM和IgG类型的诱导抗体。
鉴于头孢菌素的结构相似性及其导致DIIHA的机制，我们评估了第三代头孢菌素的凝集反应，包括头孢替肟、头孢曲松、头孢他嗪，以及第一代头孢菌素头孢唑林。
我们发现，头孢噻肟诱导的抗体在37°C时与头孢曲松发生交叉反应，导致可溶性头孢曲松存在时红细胞凝集。在立即离心时未观察到凝集，仅在使用含有可溶性头孢曲松的2me处理的血清中观察到弱的凝集强度（表2）。
此外，用生理盐水逐步稀释患者血清后，分别用立即离心和Ortho凝胶卡（抗IgG，抗c3d；多特异性）测定抗体滴度为1：128，抗体滴度为1：8（表3）。滴度测定采用AABB系列稀释法。
在我们的病例中，在整个疾病进展过程中，观察到IgM抗体的增加，随后出现了IgG抗体。在O型红细胞和头孢噻肟存在时，患者血清中检测到高水平的IgM抗体和低水平的IgG抗体。
表3 由头孢噻肟诱导的IgG和IgM抗体滴度
因此从实验室检查结果方面的结果我们判断患者发生了由头孢噻肟引起的免疫性溶血性贫血。
在第42天患者出现急性肾功能衰竭，结合病史，考虑脓毒血症不能排除，因此进行了CT检查并留取血液进行NGS检测。CT提示术区液体积聚，外科医生考虑患者可能因术后吻合口漏发生腹腔感染，导致脓毒症。
当天行剖腹探查术，见腹腔中量暗红色血性腹水，未见明显脓苔及粪汁样液体，盆腔原吻合口处瘘口已封闭，未见明显渗出。术中患者出现弥散性血管内凝血，予以红细胞、血浆、冷沉淀等血制品输注后血性渗出明显减少，弥散性血管内凝血逐步控制。后续NGS结果显示患者血液为阴性，因此排除感染导致的脓毒症。
结合患者溶血症状、病史、药物服用史以及输血实验室检查，综合考虑患者发生了由头孢噻肟引起的免疫性溶血性贫血，从而导致一系列溶血症状。
药物诱导免疫性溶血性贫血（DIIHA）血是由特异性抗体破坏红细胞引起的，导致诸如胸部不适、呼吸困难、肾功能衰竭和严重时的死亡等症状。是一些治疗药物的副作用，其发生率为10万分之一，可导致严重的健康并发症，包括血红蛋白水平大幅降低、明显的血红蛋白尿、肾功能衰竭，甚至死亡。
虽然很罕见，但DIIHA的发展主要是由三种机制驱动的。第一个是通过药物依赖性抗体。这些抗体是在已实施的药物存在的情况下，针对红细胞（RBC）的抗体。药物依赖机制有两种亚型；(a)抗体对药物包被的红细胞有反应;(b)在可溶性药物存在时形成免疫复合物，随后结合并损伤红细胞。
第二种机制是通过药物独立的自身抗体。与第一种机制不同的是，这涉及到攻击红细胞的自身抗体，而不管血清中是否存在药物。例如，与甲基多巴、左旋多巴和卢达拉滨相关的自身抗体。
最后，第三种机制被称为非免疫蛋白吸附（NIPA）。这种机制与前两种不同，因为它没有直接参与抗体，而头孢替坦和奥沙利铂已出现。在NIPA中，该药物修饰红细胞膜，允许蛋白质非特异性吸附到细胞表面，可能导致溶血，而没有传统的免疫反应。DIIHA的诊断包括确认药物与溶血之间的时间关系，可能的DAT阳性，以及实验室检测到潜在的药物诱导抗体。
在本案中，患者在反复接触头孢噻肟后出现严重症状，并发生免疫反应，导致产生大量针对红细胞的特异性抗体。这种免疫反应触发了急性血管内溶血，表现为红细胞碎片化、网织红细胞计数增加、血红蛋白脱氧小量降低以及尿液中存在血红蛋白。因此，大量的红细胞碎片通过肾脏排出，严重损害了肾功能，导致肾功能衰竭[2]。
在我们病例的疾病进展过程中，观察到IgM抗体水平增加，随后出现IgG抗体。在O型红细胞和头孢噻肟存在的情况下，检测到患者血清中的IgM抗体水平较高，而IgG抗体水平较低。
鉴于头孢菌素的结构相似性及其导致DIIHA的机制，我们使用患者血清和O型红细胞在不同条件下进行了头孢噻肟、头孢曲松和头孢哌酮的凝集反应测试。我们发现头孢噻肟诱导的抗体只与头孢曲松轻微交叉反应。头孢噻肟、头孢曲松和头孢哌酮被归类为第三代头孢菌素，而头孢曲松是第一代头孢菌素。
与先前研究一致，头孢曲松诱导的抗体显示出与头孢噻肟的交叉反应，但与头孢哌酮或头孢菌素无交叉反应[3]。尽管如此，在诊断头孢菌素诱导性溶血性贫血时，建议停用所有头孢菌素。
患者的溶血性贫血在立即停用头孢噻肟并进行两次血浆置换和红细胞输注后得到有效管理。血浆置换分别在第44天和第49天进行，每次通过体外循环置换换出2000毫升血浆。
这个案例以及其他案例强调了在出现不明原因的血红蛋白水平下降和使用抗生素的病史的患者中考虑DIIHA的必要性。通过血清学测试检测到特定药物依赖性抗体需要立即停用药物，进行治疗性血浆置换和支持性输血相关干预。
点评专家： 王学锋 上海交通大学医学院附属瑞金医院临床输血科
免疫性溶血性贫血是由特异性抗体破坏红细胞引起的，可导致胸部不适、呼吸困难、肾功能衰竭等症状，严重者可导致死亡。虽然罕见，但DIIHA主要与三种免疫机制相关:药物依赖性抗体、药物非依赖性抗体和非免疫机制，如NIPA。DIIHA的诊断包括确认药物与溶血之间的时间关系，可能阳性的DAT和潜在的药物诱导抗体。
作者描述了一例头孢噻肟引起的免疫性溶血性贫血，进一步支持了DIIHA的实验室诊断。与头孢曲松类似，头孢噻肟是第三代头孢菌素。
在本例中，患者表现出严重的症状，并在反复暴露于头孢替肟后发生免疫反应，导致产生针对红细胞的特异性抗体。这种免疫反应引发急性血管内溶血，其特征是红细胞碎裂，网织红细胞计数增加，触珠蛋白水平降低，尿液中存在血红蛋白。结果，释放的游离血红素和大片段红细胞通过肾脏排出，严重损害肾功能，最终导致肾功能衰竭。
在本病例的整个疾病进展过程中，观察到IgM抗体增加，随后出现IgG抗体。在o型红细胞和头孢替肟存在的情况下，患者血清中检测到高水平的IgM抗体和低水平的IgG抗体。患者的溶血性贫血在立即停用头孢噻肟后得到有效控制，并辅以两次血浆交换和红细胞输血。
那么这个案例对于我们的思考在于：患者如果出现了意外的溶血症状以及大量的血红蛋白下降，存在服用抗生素药物史时，临床上需要多方面考虑，并把药物导致的溶血性贫血列入考虑范围会同输血科一起讨论并行相应实验室检查。基于此，临床检验（临床输血）应与临床科室更加紧密的联系起来，这样才能更好的为患者提供诊疗服务。
参考文献
[1]CLAUDIACOHN M D, SUSAN T. JOHNSON, LOUIS M. KATZ, JOSEPH (YOSSI) SCHWARTZ.AABB technical manual. 21th ed. [J]. Bethesda, MD: AmericanAssociation of Blood Banks; 2023,
[2]GARRATTYG. Drug-induced immune hemolytic anemia [J]. Hematology AmericanSociety of Hematology Education Program, 2009, 73-9.
[3]GARBEE, ANDERSOHN F, BRONDER E, et al. Drug induced immune haemolyticanaemia in the Berlin Case-Control Surveillance Study [J]. BritishJournal of Haematology, 2011, 154(5): 644-53.