来源：BioSyn世纪
论文的研究目标及其重要性
本论文于2024年10月25日在线发表于JACS。旨在利用生物合成指导和修饰酶催化的方法,发现新的 dhilirane 型杂萜化合物 (DMs)。DMs 是一类罕见的真菌杂萜,具有独特的 6/6/6/5/5 环系统,迄今为止仅分离鉴定了 11 个。论文希望通过基因组挖掘、代谢物分析和修饰酶催化等手段,充分探索 DMs 的化学多样性。这对于开发新型杀虫剂和抗炎药物具有重要意义。
论文开篇指出:
Dhilirane-type meroterpenoids (DMs) featuring a 6/6/6/5/5 ring system represent a rare group of fungal meroterpenoids. To date, merely 11 DMs have been isolated or derived, leaving their chemical diversity predominantly unexplored.
可见,发现结构新颖、活性优异的 DMs 类化合物,是天然产物药物开发的重要课题。
论文提出的新思路和方法
论文提出了一种"生物合成指导和修饰酶催化"(biosynthesis guidance and tailoring enzyme catalysis)的药物先导发现工作流程,包括:
利用 基因组挖掘 (genome mining)和 代谢组学分析 (metabolite analysis),从南极真菌 P. purpurogenum AN13 中发现了 7 个新的 DMs (2-8),其中包括两个前所未见的骨架。
通过 异源表达实验 (heterologous expression experiments)证明, α-酮戊二酸依赖的双加氧酶 DhiD 催化 dhilirolide D 的 B 环缩合,形成 DMs 的 dhilirane 骨架; 细胞色素 P450 DhiH 则通过形成不同的 C-C 键和氧化反应,极大地重塑了结构多样性。
晶体学和定点突变实验 阐明了 DhiD 反应的分子机制及其 立体发散 产物的形成基础。
与传统的活性筛选为主的药物发现模式相比,本研究基于生物合成途径分析和关键酶催化拓展,可以更有针对性地发现结构新颖的天然产物,并对骨架进行定向修饰,极大地丰富了化合物库。这为药物先导发现开辟了新思路。
利用生物合成和酶催化发现新型 Dhilirane 型杂萜类天然产物
本研究利用生物合成指导和修饰酶催化相结合的策略,在南极真菌 Penicillium purpurogenum AN13 中发现了 23 个新的 Dhilirane 型杂萜化合物 (DMs), 其中包括 7 个前所未见的碳骨架。这些发现极大地丰富了 DMs 的化学多样性,为药物先导发现开辟了新的Chemical space。
从真菌 P. purpurogenum AN13 中发现 7 个新的 DMs
作者首先通过生物信息学分析,在南极真菌 P. purpurogenum AN13 的基因组中发现一个 杂萜生物合成基因簇 (dhi),其中包含 PKS、PT、TC 等 DMs 生物合成所需的核心基因,以及两个特有的修饰酶基因 dhiD 和 dhiH。随后,从该菌株的代谢物中分离鉴定了 7 个新的 DMs (2-8),包括两个前所未见的骨架结构(图 2):
Subsequent chromatographic separation of the meroterpenoid-containing fraction resulted in the isolation of seven new DMs, namely, dhilirolides O−U (2−8) including two unprecedented scaffolds (2 and 3).
这些新化合物的结构均通过 NMR、HRESIMS 和 X-ray 等波谱学方法确证。其中化合物 2 具有一个罕见的 6/6/6/6/5/5/6 七环骨架。这些发现表明,真菌 P. purpurogenum 是 DMs 的重要来源,基因组挖掘与代谢物分析相结合, 可以高效发现结构新颖的天然产物。修饰酶基因 dhiD/dhiH 的存在暗示其在 DMs 结构多样性形成中的重要作用。
图2
2. DhiD 催化 B 环缩合反应形成特征性 dhilirane 骨架
为验证 DhiD 和 DhiH 在 DMs 生物合成中的功能,作者将其在 Aspergillus nidulans 中进行异源表达,并以 dhilirolide D (1) 为底物进行生物转化实验。结果显示(图 3):
It is noteworthy that 1 was converted into six metabolites, including 2, 3, and 11 with +m/z 457; 13 and 14 with +m/z 441; and 15 with +m/z 455, which were not detected in the AN control strain (Figure 3A and F). Subsequently, dhiD and dhiH were individually introduced into AN and fed with 1 as a substrate. No biotransformation was observed in the negative control and AN-dhiH, while two products with the same molecular weight of 440 were observed in AN-dhiD, which were further identified as dhilirolides J (13) and L (14) by NMR and MS data after scale-up fermentation (Figure 3B and F). These results suggest that dhiD is responsible for the ring contraction of dhilirolide D to construct the dhilirane skeleton.
图3
体外酶学实验进一步证实(图 4),DhiD 以 Fe(II) 和 α-酮戊二酸 为辅因子,将化合物 1 转化成 13、14 和 17。当13 作为底物时,DhiD 可进一步将其转化为 17 (C-6 酮化)、18 (C-6 羟基化)和 19 (Δ3/4 和 Δ5/6 双键异构化)。这些结果表明,DhiD 是一个多功能的α-酮戊二酸依赖的双加氧酶,可以催化 B环缩合形成 dhilirane 骨架,并对骨架进行多样的修饰,在 DMs 结构多样性形成中起关键作用。
图4
3. 晶体学和定点突变揭示 DhiD 反应的分子机制
为了解 DhiD 催化的 B 环缩合反应机理,作者解析了 DhiD 的晶体结构(2.58 Å),发现其活性中心存在一个由 2-His-1-Asp 组成的 facial triad。同时,分子对接模拟显示,底物化合物 1 上的 C-13 位点距 Fe(IV)-oxo 中心最近,暗示 DhiD 可能通过 自由基机制 启动 B 环缩合反应。
基于对接模型,作者进一步开展了 定点突变实验 (图 5)。结果显示,DhiD 的 8 个关键残基突变体中,H116A 和 V137A 显著降低了化合物 14 的生成,但对 13、17 和 18 的产量影响较小。结构分析表明,H116 可以稳定 B 环缩合的关键中间体 I-3。作者由此提出了 DhiD 催化 B 环缩合的分子机制(图 5E):
Based on these results, we thus proposed that the Fe(IV)-oxo species first abstracted hydrogen on C-13 of 1, followed by intramolecular electron transfer and semipinacol rearrangement via an intermediate with nonstereocenter at C-13 to produce two diastereoisomers 1a and dhilirolide M (1b). The spatial approximate of ketone C-14 in 1a toward OH-9 allowed a successive nucleophilic addition across C-9/C-14 and C-14/C-10 of 13, whereas 13-epimer 1b might go through an oxa-Micheal addition to derive 14, which was likely mediated by a nonenzymatic process (Figure 5E).
图5
首先,Fe(IV)-oxo 从化合物 1 的 C-13 上提取一个氢原子,生成自由基中间体 I-1/I-1';随后经分子内电子转移和 半频哪醇重排,生成在 C-13 位无手性中心的中间体 I-2 和 I-3。中间体 I-3 的 C-14 羰基与 OH-9 距离较近,经分子内亲核加成,生成 C-9/C-14 和 C-14/C-10 环化产物 13;而中间体 I-2 则经 9,14-环氧 Michael 加成,生成 C-13 差向异构体 14。H116 和 V137 可能通过稳定中间体 I-3,影响反应的 立体选择性。
以上机理表明,DhiD 催化的 B 环缩合反应经历自由基历程,涉及半频哪醇重排过程,生成在关键手性中心无立体选择性的中间体,从而产生差向异构的产物。定点突变实验揭示了关键残基在调控反应立体选择性中的作用。
4. 酶催化实验显著拓展 DMs 的化学多样性
为进一步考察 DhiD 的底物适用范围,作者选取化合物 8、10 和 12 为底物,进行了体外酶催化实验。令人惊喜的是,DhiD 可以接受这些结构差异较大的底物,并催化多样的反应,生成 16 个新的 DMs 衍生物,其中包括 5 个前所未见的骨架(图 6)。
DhiD surprisingly catalyzed dhilirolide U (8) to generate five derivatives 23−27 (Figures 6 and S154−S197, Tables S15-S19). In addition to the C-13 hydroxylation and Δ5/6 epoxidation products (23−25), products 26 and 27 with the oxidative cleavage of ring D were identified by extensive spectroscopic data in association with X-ray diffraction data (Figure 6B). 26 is characterized with a lactone across C-13 and C-10, while 27 has an aldehyde group at C-22 and C-10 decarboxylated structure. They might share a common intermediate 24a with a 9-ketone and 10-carboxylic unit, which can be derived via an oxidative cleavage of the C-9/C-10 bond of 24 (Figure S16). Further formation of the 10,13-lactone allowed the generation of 26, while 21,22-epoxidation of 24a following decarboxylation could result in the production of 27 (Figure S16). It is noteworthy that 26 and 27 represent the uncommon 6/6/5/6/5 and 6/6/6/5 spiro-lactone scaffolds, respectively.
图6
当化合物 10 (dhilirolide B)为底物时,DhiD 可以催化与 dhilirolide J (13) 类似的异构化(22)和氧化反应(20 和 21):
Dhilirolide B (10) is a 21,22-epoxidized derivative of dhilirolide J (13). 10 was catalyzed by DhiD to produce three derivatives 20−22 with 21 as the main product (Figure 6A). 20 and 21 were characterized to be 6-hydroxylated and 6-ketone derivatives of 10, respectively, by MS, NMR, and X-ray diffraction (Figures 6B and S128−S145, Tables S12 and S13). 22 with a 3,5-diene moiety might be converted from 10 via olefin rearrangement (Figures 6B and S146−S153, Table S14).
当化合物 12 (dhilirolide I)为底物时,DhiD 的催化产物更加多样。除了经典的环缩合反应生成 28-30 外,还可以催化独特的 C-9/C-14 偶联生成化合物 31 和 32,这可能涉及自由基历程:
DhiD converted dhilirolide I (12) to five new meroterpenoids (28−32; Figures 6 and S198−S241, Tables S20−S24). Similar to 1 converted by DhiD, 28−30 were identified as the ring contraction products by semipinacol rearrangement via a possible intermediate 12a (Figure S16). 29 and 30 share a new 6/6/6/6/6/5/5 scaffold. Product 28 could derive from a 10-epimer of intermediate 12a. The unprecedented scaffolds 31 and 32 demonstrate 6/6/5/5/6/6/6 and 6/6/6/6/5 ring systems, respectively. They are likely derived from a radical intermediate 12b, which could be resulted from a semipinacol coupling between C-9 and C-14 of 12a (Figure S16). Different C−C bond cleavage patterns were involved in the production of 31 and 32.
这些结果充分展示了 DhiD 在催化 DMs 结构多样化中的显著作用。
It is noteworthy that DhiD exhibited catalytic versatility in chemical expansion of DMs via various reactions to produce 16 new DM derivatives, including five unprecedented scaffolds (Figure 1B).
图1
除了经典的环缩合反应外,DhiD 还可以催化底物的羟基化、脱氢、环氧化、异构化、外消旋化和 α-酮醇裂解等反应,极大地拓展了 DMs 的化学空间,为药物先导发现提供了更多选择。
研究成果的学术和产业影响
从学术角度看,本研究阐明了 DMs 生物合成途径中 DhiD 和 DhiH 的关键作用,尤其是前者催化 B 环缩合这一反应的新颖性,极大地拓展了对杂萜生物合成的认识。DhiD 表现出的多样催化活性,为杂萜骨架的定向修饰提供了新的酶学工具。
此外,一些新发现的 DMs 类化合物表现出良好的抗炎和杀虫活性:
Notably, DhiD exhibits substrate-controlled catalytic versatility in the chemical expansion of DMs through ring contraction, hydroxylation, dehydrogenation, epoxidation, isomerization, epimerization, and α-ketol cleavage. Bioassay results demonstrated that the obtained meroterpenoids exhibited anti-inflammatory and insecticidal activities.
未来研究方向和机遇
本研究虽然极大地丰富了 DMs 类化合物的结构多样性,但仍有许多问题值得进一步探索:
DhiD 和 DhiH 与其他真菌杂萜 BGCs 组合表达,有望催生更多结构新颖的衍生物。可以开发基于 DhiD/DhiH 的定向进化策略,进一步拓展底物适用范围和催化活性。
对具有抗炎/杀虫活性的 DMs 类化合物,需要深入开展构效关系研究,优化药效团,并评估体内药代动力学性质和安全性。基于Structure-Activity Relationship 的半合成修饰策略可能是一个有前景的方向。
DhiD 的结构与功能研究表明,α-KG 依赖的双加氧酶是一类催化功能强大的酶,在天然产物骨架多样化中有广阔应用前景。可以建立高通量筛选平台,针对性地挖掘和改造此类酶,用于组合生物合成。
Critical Thinking
尽管本研究在 DMs 结构多样性和催化机制方面取得了重要进展,但仍存在一些不足:
DhiD 和 DhiH 与其他修饰酶(如甲基转移酶、氧化酶等)在 DMs 生物合成中的相互作用尚不明确。需要更多的代谢组学和蛋白质组学证据,阐明 dhi 簇中各基因的功能,揭示完整的生物合成网络。
对于一些新发现的 DMs,其生物活性评价尚不全面。除了抗炎和杀虫活性外,还应该考察其抗菌、抗肿瘤等多种药理活性。活性筛选模型也应更加多样化,包括动物模型评估。
DhiD 和 DhiH 的底物适用范围评估仍有局限,本研究只考察了几个分离到的 DMs。理想的情况是构建 DMs 类似物库,系统评估这两个酶的底物柔性,这将为合成生物学应用提供更丰富的素材。
DhiD 结构解析分辨率(2.58 Å)还有待提高,以期获得更精细的结构信息,并据此开展理性设计和定向进化。此外,DhiD-底物复合物结构亟待解析,这将为阐明底物识别和催化机制提供直接的结构生物学证据。
Biosyn导师：范爱丽 http://dnm.sps.bjmu.edu.cn/szdw_20180110150803713087/hyywyjs/225317.htm
教育背景
2011. 9-2015. 7，博士，药学与生物技术，德国马尔堡大学
2009. 9-2011. 7，硕士，天然药物化学，北京大学
2005. 9-2009. 7，学士，药学，北京大学
工作经历
2020. 12-，副研究员，北京大学
2015. 9-2020. 11，副教授，北京化工大学
2015. 10-2017. 8，助理研究员，中国科学院微生物研究所
科研与教学服务
研究生必修课《天然药物前沿概论》授课教师
研究方向
1.基于生物合成和合成生物学的海洋天然产物发现
2.海洋天然产物生物合成途径解析及关键酶催化机制探究
3.基于异源表达/代谢调控的活性药源分子生物制造
研究项目
2022.11，科技部重点研发青年科学家项目，项目负责人
2022.01，国家自然科学基金面上项目，项目负责人
2019.07，科技部重点研发计划，子课题负责人
2019.01，国家自然科学基金青年基金项目，项目负责人