在神经生物学研究领域，神经类器官作为至关重要的模型工具受到广泛关注。三维干细胞衍生模型已然成为细胞生物学不可或缺的一部分，而神经类器官更是其中的研究热点所在。早期研究虽已斩获一定成果，例如在Matrigel中生成神经类器官，然而，Matrigel作为肿瘤来源的细胞外基质，其成分不明确，在控制神经细胞分化的机械与生化特性方面存在局限，所生成的细胞比例和组织方式也无法完全代表体内成熟或胎儿的细胞群体，这些问题对其在疾病和发育模型研究中的应用形成了限制。
因此，寻觅更优质的培养基质，以提升神经类器官中神经细胞群的代表性和健康状况，成为当前研究的关键方向。同时，尽管细胞命运可通过细胞外信号调控，但关于细胞外基质（ECM）对神经类器官影响的研究相对匮乏，这也为探索新型基质创造了机遇。
近日，美国范德比尔特大学Ethan S. Lippmann研究团队在Cell Rep发表了题为Biofunctionalized gelatin hydrogels support development and maturation of iPSC-derived cortical organoids的研究论文。本研究对Matrigel和N-cadherin肽功能化明胶甲基丙烯酰水凝胶（GelMA-Cad）在皮质神经类器官培养中的影响进行了对比。研究发现，肽的呈现能够调节分化过程中的细胞命运和多样性，GelMA-Cad培养的类器官更贴近人类胎儿群体，神经元的自发兴奋性突触后电流更多，这证明基质连接的信号肽可影响分化，GelMA-Cad可作为Matrigel的替代物用于神经类器官培养。此项研究为培养提供更优基质，有助于提高细胞代表性，对神经生物学和疾病建模具有重要意义，同时也为开发其他水凝胶提供了思路。
基质特性对早期皮质类器官形态的影响
本研究通过筛选，确定了合适的N-cadherin肽密度和交联剂浓度组合，发现水凝胶的机械性能与肽的存在基本无关。在形态方面，不同基质中培养的类器官存在显著差异。GelMA和GelMA-Cad嵌入的类器官在第10天保持紧凑，第30天比Matrigel中的更小，但圆形度相当，且N-cadherin肽可促进神经突延伸。
scRNA-seq分析表明，基质条件影响细胞轨迹，Matrigel中细胞核糖体相关转录本上调，可能增殖增加，并且Matrigel衍生类器官中存在神经板等相关细胞，明胶基质类器官中基本不存在，神经板细胞特异性在明胶基质中增加。
图 1. 用于皮质类器官培养的功能化明胶基质参数
图 2. 基质特性决定早期皮质类器官形态
GelMA-Cad对皮质神经元发育的促进作用
在长期培养条件下，基质条件影响后期出生的神经元数量和分布。上层兴奋性神经元在GelMA或GelMA-Cad嵌入的类器官中比在Matrigel中略有增加，对SATB2+细胞厚度的测量结果也支持这一结论。对兴奋性神经元转录组的分析显示，Matrigel中生成的兴奋性神经元富集于与细胞应激相关的KEGG通路，GelMA-Cad类器官中富集的顶级转录本编码神经成熟相关蛋白，暗示神经成熟。
图 3. 第60天时皮质类器官中的神经元命运结果及组织情况
长期培养过程中类器官细胞命运的分化
在4个月时，低交联剂浓度的水凝胶降解，高交联剂浓度的水凝胶保持完整。不同基质中类器官的scRNA-seq分析表明，细胞类型存在显著差异。GelMA产生大量间充质细胞和脉络丛上皮细胞，GelMA-Cad产生强大的神经和胶质细胞群，这凸显了N-cadherin肽的重要性。通过scRNA-seq数据对细胞进行多种评分，GelMA-Cad或GelMA与Matrigel相比，除一个案例外得分均值在一个标准差内。
交联剂浓度影响脉络丛上皮细胞出现，GelMA-Cad水凝胶中深层和上层兴奋性神经元数量更多。将GelMA-CadHC和Matrigel衍生的转录组数据集与胎儿数据集整合后发现，GelMA-Cad嵌入的类器官中异常值细胞比例更小，在第60天GelMA-Cad中细胞应激比Matrigel中显著降低，在其他时间点无显著差异。
图 4. 后期时间点类器官细胞组成的差异
皮质类器官的电生理特性
通过全细胞膜片钳电生理学方法对分化第90天的类器官进行研究，发现GelMA-Cad嵌入的类器官中神经元的自发兴奋性突触后电流（sEPSCs）在检测到的神经元百分比以及频率上均高于Matrigel嵌入的类器官，平均sEPSC振幅无差异，第120天GelMA-Cad衍生的神经元的sEPSCs频率仍高于Matrigel衍生的神经元。对膜兴奋性的研究表明，GelMA-Cad嵌入的类器官中的神经元能产生比Matrigel嵌入的类器官中神经元显著更多的动作电位，第120天差异不明显，这表明GelMA-Cad水凝胶中皮质类器官的突触网络成熟加速和膜特性的早期成熟。
图 5. 第90天时类器官的电生理特性表征
GelMA-Cad水凝胶对放射状胶质细胞多样性的影响
通过对第90天和第120天scRNA-seq数据中放射状胶质细胞的分析，识别出七个聚类。在第120天，纤毛和神经发生的放射状胶质细胞在GelMA-CadLC和GelMA-CadHC中的比例高于GelMA或Matrigel嵌入的类器官。与胎儿组织图集比较，纤毛放射状胶质细胞与妊娠第22周截断的放射状胶质细胞共享最多标记基因，神经发生放射状胶质细胞与妊娠第18周外层放射状胶质细胞/星形胶质细胞共享最多标记基因。
对细胞外基质有反应的两个聚类表现出不同特征，聚类1可能是早期星形胶质祖细胞，聚类2在GelMA中高度富集，与胎儿图集映射不佳且与间充质细胞比例相关。所有类器官都存在与核糖体生物发生相关的放射状胶质细胞，映射到最早的妊娠数据，与未指定的神经元群体密切相关。总体而言，GelMA-Cad嵌入的类器官产生的异常细胞类型比例最小，对发育相关细胞类型的代表性最强。
图 6. 后期时间点放射状胶质细胞表征
总体而言，该研究对比了Matrigel和GelMA-Cad对皮质神经类器官培养的影响，结果显示GelMA-Cad在多个方面展现出优势。其基质特性影响早期类器官形态，促进皮质神经元发育，在长期培养中使细胞命运分化更优，类器官电生理特性更佳，且产生的放射状胶质细胞多样性更符合人类胚胎发育。这些结果表明GelMA-Cad可作为Matrigel的替代物用于皮质类器官培养，有助于提高神经细胞群的代表性，对神经生物学研究和疾病建模意义重大，同时为开发其他肽功能化水凝胶提供了思路。
参考文献：
Kjar A, Haschert MR, Zepeda JC, et al. Biofunctionalized gelatin hydrogels support development and maturation of iPSC-derived cortical organoids. Cell Rep. Published online October 17, 2024. doi:10.1016/j.celrep.2024.114874