革兰阴性和阳性细菌之间，竟可以“交换”抗生素抗性基因？柳叶刀子刊：细菌质粒能够跨菌门传播

抗生素耐药性、尤其是碳青霉烯耐药性的广泛传播，是全球公共卫生领域面临的巨大挑战。关键的“抗性基因”——blaNDM基因，其传播加速了碳青霉烯耐药性在全球范围内的扩散，并且这种基因在非临床环境中也被广泛观察到。NDM-5的存在引起了人们的广泛关注，它通过质粒传播，可能对抗生素耐药性产生重要影响。

目前仍缺乏关于新德里金属-β-内酰胺酶(NDM)-5阳性质粒在细菌群落内转移多样性或在细菌门之间传播的研究。全球范围内质粒携带的碳青霉烯类耐药性的传播是一项持续的公共卫生挑战。质粒的宿主范围对于其在细菌群落中的传播和持久性至关重要。根据寄主范围的不同，质粒被分为六个等级。IncX3质粒被归类为宿主范围中等的质粒（III级），通常在肠杆菌科的物种中发现。尚未有研究解决IncX3质粒在模拟自然微生物群落的条件下的宿主范围以及其是否能够在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌之间传播等问题。目前只有少数案例报告了从革兰氏阴性细菌向革兰氏阳性细菌的DNA转移，这些案例涉及穿梭载体或已知的广泛宿主质粒（如IncP），但这些研究从未使用与临床相关的质粒、未评估质粒的稳定性，更未研究质粒DNA向革兰氏阴性菌的转移作为反向革兰氏转移的证据。

近期，柳叶刀子刊发表了一项在中国福建省福州地区进行的医院污水微生物调查研究。通过模拟临床相关的质粒pX3-NDM-5在从医院废水中获得的自然细菌群落中的原位转移，以探索抗生素耐药性的背景。传统的培养方法无法准确描述复杂细菌群落之间的水平基因转移事件。因此，研究通过结合非培养细胞分选方法和基于培养的方法，跟踪了耐药相关质粒在医院污水细菌群落中的转移动力学。

doi: 10.1016/S2666-5247(23)00227-6.

研究方法

查询此前的研究后发现，截至2022年12月31日，关于“培养独立结合”和“碳青霉烯耐药”，或“碳青霉烯耐药”和“门间传播”的报告数量有限。在搜索结果的24篇记录中，并未发现关于非培养方法检测碳青霉烯类耐药基因水平转移的对照研究。这些结果对于理解抗生素耐药性在卫生部门的传播具有重要意义。

研究采用基于CRISPR的方法，成功将绿色荧光蛋白基因gfp标记到pX3_NDM-5质粒上，并将其转移至供体大肠杆菌中。研究人员从福建省妇幼保健院的污水处理厂提取了细菌作为受体群落，在有或无次氯酸钠(NaClO)作为环境应激源的条件下，研究人员将这一受体群体与携带gfp标记的质粒的大肠杆菌供体菌株混合，并进行了多种基于培养和非培养的接合试验。

随后，研究使用显微镜观察了合并事件，并通过荧光激活的细胞分选对其进行了定量分析。通过对分选的转移子池进行16S rRNA基因扩增序列分析，研究人员评估了分类组成，并对分离的转移子中质粒的稳定性以及它们转移回大肠杆菌的能力进行了评估。

研究结果

耐药质粒pX3_NDM-5可广泛选择宿主，同时能够在不同的细菌门之间进行转移，其中就包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间的转移。尽管存在NaClO的环境胁迫不会影响质粒转移的总体频率，但它会降低接合子池的多样性。转移子池的分类组成与受体群落的分类组成不同，环境威胁调节了部分可操作分类单位对pX3_NDM-5获取的可及性。

值得注意的是，pX3_NDM-5转移子中的基因包括革兰氏阳性病原菌粪肠球菌，随后该质粒可以重新转移回大肠杆菌。也就是说，粪肠球菌可以作为pX3_NDM-5质粒广泛传播的天然穿梭载体。

01

耐药质粒pX3_NDM-5在细菌群落中表现出强大的传播能力。研究人员采用了双荧光标记的方法，通过观察表达gfp的细胞的百分比来识别转移事件。随后运用流式细胞术研究了pX3_NDM-5对86种细菌的转移能力，并发现在混合培养中，转移子的比例在0.00%到63.78%之间变化（这种方法不需要依赖抗生素选择性标记，能够有效地检测细菌群落中耐药质粒的转移）。

研究人员还观察到，pX3_NDM-5在自然复杂的细菌群落中能够迅速而广泛地传播。通过共聚焦激光扫描显微镜观察到了绿色荧光细胞结合的事件(图1)。

图1：从大肠杆菌MG1655供体菌株向从医院污水处理厂提取的细菌群落的质粒转移

(A)在没有NaClO的情况下形成的接合体。绿色荧光表明成功获得了绿色荧光蛋白表达载体。

(B)在40 mg/L NaClO存在下形成的接合子。

(C)在100 mg/L NaClO存在下形成的接合子。

(D)供体菌株，由于用mCherry标记染色体，只能看到红色荧光。

(E)从医院污水处理厂分离的受体细菌群落。这些细菌在成功获得绿色荧光蛋白表达质粒之前是非荧光的。

NaClO=次氯酸钠。

02

通过对深度16S rRNA基因扩增序列的分析，研究人员研究了pX3_NDM-5转移子池和受体群落的分类格局。结果显示，共有231个转移子操作税单元（OTUs），分布在12个细菌门中。其中，假单胞菌是pX3_NDM-5的主要寄主，同时还涉及其他革兰氏阴性和革兰氏阳性菌门。此外，研究人员的研究还发现pX3_NDM-5质粒向受体群落中稀有细菌类群的质粒转移现象。在经过NaClO处理的组中，除了假单胞菌和芽孢杆菌外，其他15个细菌门的接合细菌丰度较低。这些都证明pX3_NDM-5质粒具有广泛的宿主范围和丰富的质粒存储库(图2)。

图2：从对照组分离的转配池的系统组成

系统树显示了所有231个已鉴定的OTU，按门分组，来自未经NaClO处理的组的转接子池。这些分支的颜色标志着不同的系统发育类群。树外围最外面的圆圈是一张热图，显示了受体群落中对数转换的相对OTU丰度。

OTU=业务分类单位。

03

在门的水平上，通过NaClO处理的两个组与未处理组的接合子池的组成有所不同。NaClO处理组中革兰氏阳性杆菌的相对丰度高于非处理组，暗示化学应激可能对受体群体和pX3_NDM-5的摄取产生潜在影响。

与对照组相比，两个NaClO处理组（尤其是接触100 mg/L NaClO组）的转合亲缘关系发生广度均减小，其中OTU多样性显著减少。虽然这些系统发育类群在门的水平上与对照组相似，但研究进一步分析了前50个转配型OTU在应激和非应激条件下透过率的相对变化，以探究NaClO应激是否调节OTU的透过性。结果显示，在这50个最丰富的OTU中，假单胞菌和杆菌门是主要的细菌门。当暴露于40 mg/L NaClO时，有16个细菌OTU显示出显著的透过性增加，尤其是属于乳杆菌科的细菌，其透过性增加了约500倍。这些发现可以解释应激组中芽孢杆菌丰度高于对照组的现象。

相比之下，当暴露于100 mg/L NaClO时，有44个OTU的透过性降低了10到1000倍。只有6个OTU表现出轻微的透射性增加，其中属于乳杆菌科的OTU1的透射性增加了约584倍，显示出对pX3_NDM-5的最高摄取能力。需要注意的是，在所有三个接合子群体中都检测到了57个OTU，这表明这些物种可能是一个核心的、普遍存在的群落。这个群落主要由假单胞菌科、肠杆菌科、乳杆菌科、根瘤科、气单胞菌科、链球菌科和摩拉菌科组成(图3)。

图3：环境压力调节细菌对质粒PX3_NDM-5的接合透过性

(A)根据在不同胁迫条件下透性的变化，对平均相对丰度大于0.01%的所有转偶池中最丰富的50个OTU进行最大似然树聚类。热图显示了每个OTU的相对透过性(δ)的变化：绿色显示的是增加的质粒接收反应，而棕色显示的是减少的反应。所有转婚池中OTU的平均相对丰度以粉红色(右)显示。OTU是按顺序上色的。

(B)显示在不同胁迫条件下形成的转接种群中共享OTUS的分布的Venn图。共有OTUS的相对丰度是通过将所有三个转接群体的转接OTU总数除以(57/305，18.7%)来计算的。OTU被定义为97%的序列相似性。

(C)来自33个家族的57个OTU在不同胁迫条件下在所有转接子池中的相对丰度。最丰富的十个科分别显示，其余的归为其他科。

OTU=业务分类单位。

04

研究人员通过在琼脂平板培养基中添加美罗培南，进行了可培养接合子的选择性分离。这种表型选择方法能够分离出pX3_NDM-5阳性的接合子。每毫升培养基中可分离出约10⁴个菌落形成单位，其中许多接合子在紫外光下表现出绿色荧光信号。通过聚合酶链式反应和16S rRNA基因扩增序列分析，研究人员确认了这些分离的菌落中存在blaNDM-5和gfp基因的存在，而在受体细菌群落中并未检测到这些基因。研究人员对分离的626株接合子进行了鉴定，并根据16S rRNA基因扩增子序列构建了系统发育树。接合子主要分布在克雷伯氏菌属、假单胞菌属、肠球菌属、肠杆菌属和大肠杆菌属中，还有少量的分属于7个低丰度属的接合子。这些数据表明，pX3_NDM-5的寄主范围比以前报道的要广泛，包括假单胞菌、芽孢杆菌和少量的类杆菌。

图4：可培养的pX3_NDM-5阳性接合子的高度系统发育多样性

620个分离的转接子的16S rRNA基因扩增序列的系统树(左)，包含来自革兰氏阳性细菌门的67个序列的区域的扩展(右)。不同的细菌门由不同的颜色表示。三角形节点代表平均分支长度距离小于0.2的折叠分支。折叠应变的数量显示在括号中。

随后的评估发现，pX3_NDM-5质粒在35个新形成的转移子中的持久性存在差异。在没有美罗培南的条件下，pX3_NDM-5的持久性显著降低。在三个粪肠球菌转移子中，pX3_NDM-5能够稳定存在15天，而在其他粪肠球菌转移子中，在5天内会丢失。此外，检测结果显示，在40个NDM-5阳性转移子中，有35个能够将pX3_NDM-5基因导入到大肠杆菌C600中，转移频率介于10^-4到10^-9之间。其中，假单胞菌的转移频率最高，其次是伯克霍尔德氏菌、肠杆菌和肠球菌。

讨论与分析

在细菌种群中，质粒和可移动遗传元件扮演着重要的角色，对抗生素耐药感染的传播起着关键作用。本研究选择了NDM-5作为耐药标志，这一标志通常与IncX3质粒相关联，但也与其他类型的质粒相关。大多数耐药基因存在于革兰氏阴性和革兰氏阳性之间的鸿沟中，这限制了革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌之间的遗传物质交换。然而，研究结果表明，pX3_NDM-5质粒在大肠杆菌和来自医院污水处理厂的微生物之间建立了接合桥梁，这一发现对研究人员对IncX3质粒寄主范围的认识提出了挑战。

质粒和可移动遗传元件在细菌种群中扮演着重要角色，对抗生素耐药感染的传播起着影响。研究选择了NDM-5作为耐药的标志物，该基因通常与IncX3质粒相关联，但也可能与其他类型的质粒相关。耐药基因主要存在于革兰氏阴性细菌中，这限制了革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌之间的遗传物质交流。而调查结果表明，pX3_NDM-5质粒在大肠杆菌和医院污水处理厂的微生物之间发挥了接合的“桥梁作用”，这对研究人员对IncX3质粒宿主范围的认识提出了挑战。

研究进一步证明，氯消毒剂NaClO可以调节pX3_NDM-5的结合路径。研究人员的实验条件模拟了含氯消毒剂在医院废水处理中的使用。在新冠肺炎大流行期间，次氯酸钠消毒剂的使用尤其普遍--例如，2020年3月，中国仅在武汉市就分发了至少2,000吨消毒剂，导致医院废水中含有高浓度的游离氯。越来越多的证据认为，含氯消毒剂促进了抗药性的传播——例如，经此类消毒剂处理的细菌被发现比未经处理的细菌更有可能获得耐药质粒。研究人员的结果表明，不同细菌获得pX3_NDM-5的差异可以被NaClO调节，在有NaClO存在的情况下，革兰氏阳性细菌门芽孢杆菌中出现了令人惊讶的高获得率。

研究发现，过去认为革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌之间很少发生临床重要质粒交换的传统观点是错误的。事实上，质粒在不同属和门的细菌之间传播更加广泛。这个发现对于后续研究中深入探讨抗生素耐药性在卫生领域传播的重要性具有重大意义。在过去的十年里，抗生素耐药性监测已经发生了实质性的变革，人类健康、动物健康和环境采样已共同进入监测范围。但要这些复杂的生物群体联系起来，还要揭示它们之间在抗生素耐药性形成方面的联系，是一项艰巨挑战——环境样本的多样性因素（如营养成分、温度、降雨量和洪水倾向）是一个重要的考虑因素。

这项研究使用医院排泄物追踪碳青霉烯类抗生素耐药性的动态，发现既往仅仅依赖于基于培养的细菌结合实验下得到的对“抗生素耐药性群体动态”的理解还非常有限。这些结果加深了人们模型质粒的pX3_NDM-5的认识，但面对愈演愈烈的抗生素耐药性发展趋势，以及耐药基因之间千丝万缕的联系，这些耐药性研究可能揭开的仅仅是它们神秘面貌的冰山一角。