生命科学
Life science
10月14日，阜外医院的研究团队在Cell Press细胞出版社旗下期刊Developmental Cell上发表了题为“RNA splicing controls organ-wide maturation of postnatal heart in mice”的研究论文。该文章利用单细胞测序技术结合细胞生物学手段，揭示了心脏发育成熟过程中不同类型细胞协同作用共同驱动心脏在器官水平成熟的分子规律，揭示了Ncbp2等RNA结合蛋白通过调控不同类型心脏细胞中的可变剪接过程进而实现心脏在器官水平成熟的新机制。
心脏是由心肌细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞等多种细胞类型有机组合形成的一种复杂器官。其中，成熟的心肌细胞是一种终末分化、再生能力极弱的细胞。在心脏损伤的情况下，心肌细胞死亡后无法再生修复，最终引起心衰并导致个体死亡。有研究报道，新生小鼠的心脏在损伤后能够完全再生，而这种再生能力在出生后第7天完全消失。鉴于心脏发育成熟过程伴随着心肌细胞再生能力的消失，因此深入阐明心脏成熟过程中的再生能力变化机制，不仅能够拓展领域对心脏发育相关理论的理解，还有望为心衰等心血管疾病中心脏的损伤修复提供理论指导和潜在靶点。
随着高通量技术的发展，国内外多个机构已经对心脏的成熟及再生过程展开了大量研究，鉴定了一系列调控心脏发育再生的关键分子，如经典的HIPPO信号通路，小RNA分子miR15、miR590，以及细胞周期调控因子CDK4、CDK1、CCNB、CCND等。但是，既往研究报道往往聚焦在心肌细胞这一特定细胞类型转录层面的调控研究，忽略了转录后的RNA加工调控以及非心肌细胞。转录组研究发现哺乳动物中约90%的基因能够发生选择性可变剪接，并广泛参与细胞分化、器官发育、肿瘤发生发展等生物学过程。但心脏发育成熟过程中，不同类型心脏细胞中的可变剪接动态鲜有报道。此外，心肌细胞只占心脏细胞总量的一小部分，心脏其他细胞类型如何协同心肌细胞参与心脏成熟，而且是否存器官水平调控的协同机制尚不明确。
针对上述研究现状，本研究团队分离提取了小鼠发育不同时间点的心脏组织进行了全长转录组单细胞测序，系统定义了包括心肌细胞，内皮细胞，成纤维细胞以及巨噬细胞在内的11种细胞类型，并构建了细胞-细胞间互作网络。结果显示，非心肌细胞广泛参与建立细胞-细互作网络，并在心脏发育过程中动态变化，提示非心肌细胞在心脏成熟过程中也扮演着重要角色，也说明心脏成熟需要不同类型心脏细胞协同（图1）。
图1. 小鼠不同发育时间点心脏单细胞转录图谱
为了揭示心脏发育过程中不同类型细胞的协同调控机制，团队分析了不同细胞类型在不同发育时间点对应高表达的基因并进行了功能富集。结果显示，各类型细胞除了高表达与细胞自身特化功能相关的特异性基因之外，还存在一群共同的发育动态基因。这些基因包括已报道的肌动蛋白基因、细胞增殖调控基因，还显著富集RNA剪接调控因子等。这一结果提示剪接调控可能是心脏不同类型细胞共用的一种调控机制。因此，团队进一步聚焦在心脏发育过程中的可变剪接变化，并将可变剪接变化与基因表达变化进行对比。意外发现，心脏发育成熟伴随着大量可变剪接被抑制，可变剪接的动态变化能够明确区分不同发育阶段而非细胞类型。上述研究结果表明，心脏成熟过程中可变剪接发生了精确的动态调控，可能参与介导着心脏发育成熟过程（图2）。
图2. 可变剪接参与调控心脏成熟
RNA结合蛋白（RNA-binding protein, RBP）是调控可变剪接的核心分子。与可变剪接被抑制相对应，心脏成熟过程伴随着不同类型细胞中大量RBP的表达下降。团队首先聚焦心肌细胞，筛选了可能调控可变剪接并介导心肌细胞成熟的NCBP2等RNA结合蛋白。实验证明，在乳鼠心肌细胞中敲低NCBP2可以促进心肌细胞肌节组装，能量代谢以及电生理活动等功能成熟；在成年心肌细胞中过表达NCBP2可以促进成年心肌细胞电生理功能幼稚化。在确实心肌细胞功能成熟的变化的基础上，团队进一步对敲低和过表达NCBP2的心肌细胞进行了转录组测序，同时构建了心肌细胞NCBP2的交联免疫共沉淀测序文库（CLIP-seq）以确定NCBP2下游结合的RNA靶点。RNA-seq和CLIP-seq的关联结果提示：NCBP2通过结合下游靶点调控可变外显子剪接水平变化，进而调控心肌细胞的发育成熟（图3-4）
图3. 敲低NCBP2促进心肌细胞功能的成熟
图4. 敲低NCBP2心肌细胞分子水平变化
在上述结果基础上，团队推测不同类型细胞中可变剪接同步变化可能是实现心脏在器官水平成熟的一条潜在通路。前期实验也已证明RBP可以通过调控心肌细胞可变剪接变化从而影响心肌细胞的成熟，在此基础上，团队尝试基于不同类型细胞中的可变剪接调控网络鉴定在器官水平调控心脏成熟的关键RBPs，最终锁定了40个可能在器官水平实现心脏成熟调控的关键RBPs，包括NCBP2、G3BP1、PTBP1等，并对这些蛋白在不同细胞类型的调控进行了细胞或在体的验证（图5）。
图5. 不同细胞类型协同调控的RBPs的筛选
团队在不同细胞类型中敲低或过表达了NCBP2、G3BP1、PTBP1等RBPs，同时利用CLIP-seq鉴定了不同RBPs在不同类型细胞中的结合靶标。基于这些数据发现，干预上述RBPs表达之后，各类型心脏细胞中可变剪接事件的变化幅度及事件个数明显多于基因表达的变化。此外，不同细胞类型的可变剪接事件可以被相同RBP同步调控。上述结果揭示RBPs能够通过协同调控不同细胞类型可变剪接变化实现心脏在器官水平成熟。此外，敲低RBPs使得心脏发育早期特异的细胞-细胞相互作用减少，而成熟期的细胞-细胞间相互作用增加，这进一步提示RBPs通过协同调控不同细胞类型可变剪接实现细胞间相互作用的改变促进心脏成熟（图6）。
在上述体外细胞实验验证的基础上，团队进一步利用体内实验进行了验证。实验证实:在小鼠心脏中过表达NCBP2后，不同类型心脏细胞均趋向幼稚化，心肌细胞的增殖能力明显增强，心脏功能和形态也趋向幼稚化。细胞间相互作用分析进一步证实：过表达NCBP2后，发育早期的细胞间相互作用增强，成熟期的细胞间相互作用减弱（图7）。这些体内体外实验结合组学数据分析均显示NCBP2调控可变剪接介导心脏在器官水平的发育成熟。
图6. RBPs通过协同调控不同细胞类型可变剪接实现细胞间相互作用的改变促进心脏成熟
图7. NCBP2过表达可以抑制心脏成熟
综上所述，团队揭示并证实RBPs介导的可变剪接调控是影响哺乳动物出生后心脏发育和功能成熟中的一项重要机制，这为心脏修复治疗策略的开发提供了新思路。
作者专访
Cell Press细胞出版社特别邀请博士后李峥进行了专访，请她为大家进一步解读。
作者介绍
曹唱唱
副研究员
曹唱唱，中国医学科学院阜外医院副研究员，长期从事RNA结合蛋白作用机制解析，在Nature及其子刊共发表论文30余篇，主持国家级科研项目3项，北京市项目1项，参与国自然重大研究计划、科技部重点研究计划等2项，入选了“中国科学院青年创新促进会”人才项目。
李峥
博士后
李峥，中国医学科学院阜外医院博士后，长期聚焦在心脏发育和再生的研究，相关研究成果发表在Protein & Cell，Nature Cell Biology，Circulation等杂志，主持博士后基金一项，申请专利6项，授权专利5项，国际专利一项，入选了“协和青年学者”博士后项目。
相关论文信息
论文原文刊载于Cell Press细胞出版社
旗下期刊Developmental Cell上