【导读】猪器官和人诱导多能干细胞（iPSC）衍生的类器官作为人类移植的替代器官引起了人们的关注，但两者都面临技术挑战。使用人类iPSC的种间嵌合器官生产，显示出克服这些挑战的前景。团队使用人iPSC来源的肾单位祖细胞（NPC）和胎鼠肾脏，成功生成了嵌合肾类器官。然而，目前的技术仅限于啮齿动物。
2024年10月8日，日本慈恵会医科大学横尾隆团队在期刊《Communications Biology》上发表了题为“Generation of human-pig chimeric renal organoids using iPSC technology”的研究论文。这项研究的重点是生产人猪嵌合肾类器官，因为猪是最有前途的异种移植物种。对现有培养系统的改造，使两个物种的肾脏能够连续发育，从而成功创建人猪嵌合肾类器官。此外，该方法可用于生成人源化异种肾，用于未来的临床应用。这项研究提供了证据，优化培养条件使早期肾脏发育超越物种障碍，从而为加速临床目的的人源化异种肾脏制造研究，奠定了基础。
关于人源化猪肾
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近年来，猪器官作为人体器官移植的替代移植物引起了人们的关注，已经进行了几项利用猪肾的开创性临床研究。一方面，近年来积极开展了利用人诱导多能干细胞（iPSC）的器官发生研究。另一方面，使用囊胚互补的嵌合体器官发生方法也引起了人们的关注，其中，人类多能干细胞被注射到囊胚阶段的胚胎中，这些胚胎经过基因工程改造，不发育特定器官。然而，由此产生的动物仍然存在伦理问题，因为很难选择性地将人类细胞专门移植到物种间生物体内的目标器官中。
通过将人类iPSC衍生的细胞注射到不同动物物种的发育器官中，来进行种间嵌合器官发生，被认为是解决器官生产中这些挑战的一种有前途的方法。事实上，在团队之前的研究中，通过利用不同物种的产前肾脏发育环境，实现了异（包括人类）嵌合肾的部分创建。此外，团队的异种移植研究表明，与成体器官移植相比，猪胎肾异源移植到成年猴子上，导致较低的免疫排斥反应。
猪被认为是最理想的器官异种移植供体，由于它们的器官大小相似、生理功能类似于人类、生长迅速，以及易于器官获取，因此，在嵌合肾生产方面具有多项优势。在猪器官的异种移植中，免疫排斥的挑战不断得到解决，团队的最终目标是通过创造人源化猪肾脏，来克服免疫障碍。
在这项研究中，为了构建一个能够跨物种肾脏发育的培养系统，团队最初修改了现有的人鼠混合类器官培养系统，以延长存活，并促进其组成物种的肾脏发育。然后，团队验证了该方法对猪胎儿肾细胞的适用性，最终实现了人猪嵌合类器官的创建。重要的是，确定的培养条件不仅适用于人类异种嵌合肾类器官，也适用于人类异种嵌合肾，未来可用于临床研究。
嵌合肾类器官组成的培养条件优化
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团队以人小鼠嵌合肾类器官为起点，开始对培养条件进行研究。在这项研究中，团队选择了以前使用的用于NPC分化和成熟的培养基，特别是用于再聚集培养基的“NPC_Re-聚集”培养基，以及“NPC_Mat”培养基和“KR5_Mat”培养基。最初，使用含10%FBS的DMEM/F12进行再聚集，使用NPC_Mat或KR5_Mat进行成熟，在所有物种/条件下观察到类器官形成；然而，来自人类NPC的重新聚集产物，没有表现出明显的类器官形态。
另一方面，当使用NPC_Re-agg作为再聚集培养基时，在所有成熟条件下，都观察到类器官的形成。在研究的成熟培养条件中，用NPC_Mat或KR5_Mat培养的类器官，表现出特别明显的三维结构。从形态学分析中，定量证实，当NPC_Re-agg用作再聚集培养基，然后NPC_Mat或KR5_Mat作为成熟培养基时，所有3种类器官模型都表现出更大的类器官尺寸。这些研究阐明了建立3种肾脏类器官模型的新型培养条件：小鼠、人和嵌合人小鼠肾脏类器官。这意味着再聚集和成熟培养基都强烈影响肾类器官的形成，以及嵌合肾类器官的形成。
使用人小鼠嵌合肾类器官筛选培养条件。
利用选定的培养条件生成人源化异种肾
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将EGFP标记的人iPSC衍生的NPC解离成单细胞，并在E13.5小鼠胚胎的肾胶囊下注射，然后在NPC_Re-聚集培养基的气液界面培养4天。注射后立即对注射的胎鼠肾脏进行显微镜检查，发现受体肾脏的形态保持完整，并且观察到在肾包膜表面下注射的EGFP标记的人NPC的数量。到培养的第4天，定量证实受体胎鼠肾脏的大小增加，注射在胶囊下的人NPC，也表现出成比例的增大。
免疫染色分析显示，小鼠胚胎肾包膜下有厚厚的分层植入人类细胞，形成三维结构。此外，高倍率图像显示，人体细胞植入小鼠UB样结构的尖端，强烈表明形成嵌合帽状结构。这些结果表明，选择性的培养条件，有助于注射到肾下包膜下小鼠胎儿肾脏中的人类NPC的存活和嵌合体形成能力。此外，所得的嵌合结构表现出早期肾脏发育的特征，标志着在人源化异种肾脏，未来获得肾脏功能的途径上，取得了里程碑。
使用特定培养条件，评估注射人NPC的胎鼠肾脏。
结论
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这项研究提供的证据表明，科学界可以通过优化培养条件，使用人、小鼠和猪肾细胞，来实现跨物种肾脏发育。虽然进一步推进肾脏发育以获得肾功能，仍然是一个未来的挑战，但已建立的培养技术具有巨大的潜力，可以加速未来针对临床应用的人源化猪肾生成的研究。
参考资料：
1.Porrett, P. M. et al. First clinical-grade porcine kidney xenotransplant using a human decedent model. Am. J. Transplant. 22, 1037–1053 (2022).
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