中国儿童急性呼吸道感染中，4型腺病毒（HAdV-4）危害有多大？BMC：前瞻性多中心研究揭秘HAdV-4分布及遗传特征

人腺病毒（HAdV）隶属于腺病毒科的乳腺腺病毒属，是一种无被膜的线性双链DNA病毒。作为儿童急性呼吸道感染（ARI）的重要病原体之一，其检测率约为5-10%，而在重度ARI儿童中，这一比例可高达20.1%。目前，HAdV感染的治疗主要依赖于症状和支持治疗，尚无特异性抗病毒药物获批。在严重病例中，HAdV感染可能致命，尤其在免疫缺陷或免疫抑制的婴儿和儿童中，可导致气道阻塞、支气管扩张等严重临床表现及长期后遗症，对儿童的生命与健康构成重大威胁。

不同类型的HAdV具有不同的组织嗜性，从而引发不同的疾病。与呼吸道感染密切相关的类型主要包括B种（HAdV-3、7、11、14、16、21、50和55）、C种（HAdV-1、2、5和6）及E种（HAdV-4）。

HAdV-4作为引发ARI的常见类型之一，是E种的唯一成员。其原型毒株（RI-67毒株）于1953年在美国密苏里州的伦纳德伍德堡流感大流行期间首次从ARI病例中分离出来。HAdV-4多为散发性，但亦可引发局部小规模流行病或大规模爆发，并伴有死亡病例报告。例如，1980年，Faden等人报告了一例因HAdV-4感染导致呼吸窘迫而死亡的5岁半癫痫病史儿童。在广州儿童医院1988年7月至2005年1月期间因肺炎死亡的175名儿童肺组织中，通过巢式聚合酶链反应（PCR）和免疫组化分析方法，检测出16例HAdV阳性病例，其中HAdV-4占12例，高达75%，表明其可能是广州儿童致命性肺炎的重要血清型。

2013年9月，中国深圳市龙岗区一所幼儿园爆发了由HAdV-4引起的急性呼吸道感染疫情，感染病例17例，其中住院病例4例，均为5岁儿童。近年来，包括中国在内的多个国家HAdV-4相关发病率逐渐上升，被认为是此次病例流行的原因之一。Coleman等人对新加坡396名儿科患者中收集的HAdV阳性临床样本进行基因组测序，发现与2014-2015年相比，2016年至2018年新加坡总医院和KK妇女儿童医院收治的儿科患者感染HAdV-4的风险显著增加。Chen等人在台湾南部因ARI住院的儿童中发现，1999年11月至2000年3月期间，3型和7型为主要类型，而从那时起至2001年，4型成为主要类型，约占检测到的HAdV总数的52%。Ye等人研究表明，华南地区健康个体HAdV-4血清抗体阳性率为58.4%，并随年龄增长而增加。最近，有研究报道HAdV-4可能存在新的重组现象。

Zhang等人发现，2014年在香港获得的HAdV-4毒株可能经历了反向末端重复序列（ITR）的重组，从B物种的内部ITR获得了人类转录因子结合位点核因子1（NF-1），这更有利于HAdV-4在人类细胞中的复制和生长。根据限制性酶分析（REA），HAdV-4基因型可分为两个亚型：HAdV-4p和HAdV-4a。HAdV-4的Fiber蛋白具有与Coxsackie-adovirus受体（CAR）结合的区域，该区域介导HAdV-4与靶细胞之间的粘附，是HAdV-4导入靶细胞的限速因子。

截至目前，来自中国的HAdV-4毒株序列较少，基因库中发布的HAdV-4全基因组序列中只有13个来自中国，HAdV-4在中国的流行情况鲜为人知。HAdV-4疫苗虽然已经开发出来，但仅用于美国新兵，目前中国还没有应用与HAdV-4相关的疫苗或安全有效的药物。为阐明HAdV-4在中国的流行情况和遗传特征，为HAdV-4的监测、预防和控制提供数据参考，以及疫苗和药物的研发，一项发表于BMC Infectious Diseases期刊的研究，选择2017年和2020年在中国北方和南方六个省份六家医院住院的急性呼吸道感染儿童作为研究对象，收集HAdV-4阳性患者的临床数据进行临床特征分析，并对全基因组序列、Hexon、Penton碱基、Fiber和ITR基因序列进行生物信息学分析。

收集2017年至2020年在中国北方和南方6个地区（（北京、广州、温州、银川、贵阳和沈阳））住院的18岁以下ARI儿童的呼吸道样本进行HAdV检测和分型。排除入院48小时后患有ARI或近期有HAdV感染史的儿童。使用临床电子病历系统收集HAdV-4阳性患者的临床信息，用于临床特征和流行病学分析。对主要的壳蛋白和全基因组序列进行放大和测序，用于生物信息学分析。

表1 中国大陆不同地区2847例ARI患者分布及HAdV检测率

进一步排除临床数据缺失或重复或采集的呼吸道样本不合格的儿童后，最终入组了2847名ARI儿童，其中1407名（49.42%）患者来自中国北方，1440名（50.58%）来自中国南方。ARI儿童的详细地理分布见表1。性别和年龄分布见表2。男性1723人（60.52%），女性1124人（39.48%），比例为1.53:1。

表2 2847名ARI儿童基线特征

HAdV的检测率见表1。

检测到HAdV阳性样本156份（5.48%），其中67份合并感染其他常见呼吸道病毒。42例同时感染一种病毒，18例同时感染两种病毒，7例同时感染三种病毒。最常见的合并感染病毒是RSV（18例）、HMPP（13例）以及HEPA和/或HRT（19例）。成功对98份HAdV阳性样本进行了基因分型，检测到3个物种（B、C和E），包括7种基因型（HAdV-1~7）。HAdV七种基因型的检测率见表1。检测到HAdV-4阳性样本11份，分别占样本总数的0.39%和HAdV阳性样本的7.05%。11份HAdV-4阳性样本的具体信息见表1。

检出病例中，2017年2例（18.18%，2/11），2018年3例（27.27%，3/11），2019年5例（45.45%，5/11），2020年1例（9.10%，1/11）。

在6个月以下、6个月-1岁、1-3岁、3-6岁及6-12岁儿童中，分别有18.2%（2/11）、9%（1/11）、27.3%（3/11）、18.2%（2/11）和27.3%（3/11）的儿童受到影响。其中，6名为女性，5名为男性。所有11名儿童均出现咳嗽症状，10名（90.91%）伴有发热，体温峰值波动在38.2-40℃之间。

2名儿童（18.18%）患有结膜炎，3名儿童（27.27%）出现呼吸急促和喘息，其中2名儿童因呼吸困难需接受鼻持续气道正压通气（NCPAP）呼吸支持，并伴有呼吸衰竭、肝酶轻度升高等严重并发症。这两名儿童被诊断为重症肺炎，其中一名出现噬血细胞综合征，并在儿科重症监护室（PICU）接受检查。该患者还患有室间隔缺陷的潜在疾病，住院时间最长。

4名患者（36.36%）出现白细胞增多，6例患者（54.55%）血清素原和红细胞沉降率升高，7例患者（63.64%）C反应蛋白升高。所有患者的胸部X线检查均显示不同程度的异常，8名儿童（72.73%）确诊为肺炎，1名儿童（9.09%）确诊为支气管炎，2名儿童（18.18%）确诊为上呼吸道感染（URTI），1名儿童（9.09%）出现HRT混合感染。2名儿童确诊为重症肺炎，无其他病原性感染。总住院时间从4天到24天不等，所有患者均病情好转并出院，无死亡病例。

HAdV-4全基因组的系统发育分析：本研究从广州患者中分离出两株HAdV-4毒株，其全基因组序列与中国现有的13个参考序列及全球流行毒株位于同一系统发育分支（4a）。这些毒株与中国的流行株具有高度相似性，碱基和氨基酸序列一致性分别为98.2-99.9%和98-99.8%，遗传距离为0.000。研究还发现，4a组和4p组内的平均遗传距离为0.001，两组之间的平均遗传距离为0.038（图1）。

图1 HAdV-4全基因组的系统发生分析

系统发生树是通过邻居连接法和Kimura双参数模型使用1,000个重复构建的。之前在中国获得的HAdV-4全基因组序列用青色点表示。粉红点表示原型毒株和疫苗毒株。本研究中获得的菌株用红点表示

六邻体、五邻体碱基和Fiber基因的系统发育分析：从11份HAdV-4阳性样本中成功获取了Hexon、Penton碱基和Fiber基因序列，这些基因的相似性和遗传距离均显示高度一致性。系统发育分析显示HAdV-4存在4a和4p两个分支，本研究中的11种分离毒株均属于4a分支，而原型和疫苗毒株属于4p分支。不同基因的系统发生树分析显示，4a和4p分支内的遗传距离较小，而分支间的遗传距离较大。不同国家的菌株未表现出显著的地理聚集性（图2）。

图2 三个主要外壳蛋白基因的系统发生分析

通过邻居连接法和Kimura两参数模型使用1,000个重复构建了（A）六邻体、（B）五邻体碱基和（C）Fiber基因的系统发生树。之前在中国获得的HAdV-4的三个主要外壳蛋白基因序列用青色点表示。粉红点表示原型毒株和疫苗毒株。本研究中获得的分离株的序列用红点表示

氨基酸变异分析：本研究比较了HAdV-4原型菌株与HAdV-4a和HAdV-4p亚型的氨基酸序列差异。在Hexon蛋白的Loop 1和Loop 2区域，HAdV-4a亚型分别有9个和1个氨基酸取代，而HAdV-4p亚型在这些区域无取代。Penton碱基蛋白的Gordo环区和HVR 1区中，HAdV-4a亚型有7个氨基酸取代，HAdV-4p亚型无取代。Fiber蛋白的Knob区域中，HAdV-4a亚型有3个氨基酸取代，HAdV-4p亚型无取代。这些取代主要集中在HAdV-4a亚型中，而HAdV-4p亚型在这些区域保持原型菌株的氨基酸序列（图3）。

图3 三种主要外壳蛋白的氨基酸变异分析

(A)Hexon的环1和环2中的氨基酸。(B)Penton碱基的RDX环和HVR 1中的氨基酸。(C)与CAR和纤维旋钮结合的关键区域中的氨基酸。

在HAdV-4原型菌株RI-67中，Loop 1的位置位于Hexon的135-297个氨基酸，Loop 2的位置位于Hexon的401-451个氨基酸。RDX Loop的位置位于Penton碱基的295-353个氨基酸处，HVR 1的位置位于Penton碱基的146-165个氨基酸处。与CAR结合的区域为253、255、256和274个氨基酸位置，而Knob的区域为Fiber的318-425个氨基酸位置

ITR的核苷变异分析：通过ITR区域的碱基变异分析（图4），发现中国的大多数HAdV-4序列，包括本研究中获得的所有11个分离株，以及自1978年以来来自其他国家的大多数流行株都具有NF-I结合位点。然而，在HAdV-4p亚型和猿猴腺病毒（SAdV）的ITR中也没有发现它。HAdV-4中的NF-I与B种中的NF-I几乎相同。

图4 ITR区的核苷变异分析

本研究获得的11个ITR基因序列、原型毒株、疫苗毒株、过去在中国获得的ITR基因序列、首次发现适应宿主的NF-I结合位点的HAdV-4毒株（Genbank登录号：KX384956，V0014/France/1978）以及除HAdV-4外的其他HAdV类型均如图所示。在V0014株中，NF-I是图中所示ITR序列部分的20-33个碱基位置

HAdV进化的重要机制之一是基因重组。既往研究表明，HAdV-4是一种间重组的动物源性病毒。该病毒的基因组骨架源自SAdV-26，HAdV-16嵌入HAdV-18。利用Simplot v3.5.1软件对本研究获得的两个全基因组序列和原型菌株进行重组分析。没有新的重组。

本研究乃中国针对儿童HAdV-4急性呼吸道感染之最大规模探索，其地理覆盖之广、研究中心之众，皆为迄今之最。此项前瞻性多中心研究揭示，研究期间因ARI住院儿童中，HAdV-4阳性检测率占样本总数的0.39%，HAdV阳性样本中则占7.05%。Li等人在2013至2014年间，自华南四省门急诊室住院或治疗的ARI儿童中分离出HAdV-4样本，其检测率分别为总样本的0.11%及HAdV阳性样本的2.99%，较本研究为低。此差异或因研究时长之短及仅采鼻腔拭子样本所致，亦或昭示近年来中国HAdV-4发病率之上升趋势，亟需更多关注。

HAdV-4阳性检测率与国外研究差异显著，其范围为总样本的0.04%至25.13%，HAdV阳性样本则为2.07%至26.9%。此差异或源于国外研究多为单中心，研究领域、检测方法、纳入患者人数、患者年龄、样本来源与采集时间、研究时长及当时腺病毒流行率等皆有不同。Coleman等人基于既往研究指出，HAdV-4主要影响军事人员，占所有病例的88.5%，而包括儿童在内的一般人群发病率仅为11.5%，较低。

在本研究中，HAdV-4感染儿童主要表现为发热与咳嗽，两名儿童伴有结膜炎，另有两名儿童被诊断为严重肺炎并伴有严重并发症。Coleman等人报告，HAdV-4感染可导致URTI等常见呼吸道疾病、肺炎及结膜炎、角膜结膜炎等眼部疾病，疾病严重程度从轻度至自限性，乃至严重甚至死亡，住院治疗频繁。多数国内外文献报道，HAdV-4感染中呼吸道疾病最为常见。与其他常见呼吸道病毒相比，包括HAdV-4在内的HAdV感染更易导致发热（体温≥38℃），而呼吸急促、呼吸困难频率相对较低。呼吸道HAdV中，HAdV-3、HAdV-4及HAdV-7主要与严重感染相关，尤以HAdV-7为甚，其复制能力与毒力更强，能促进并加剧细胞因子反应，导致更严重的呼吸道炎症。

在越南、希腊、尼日利亚、突尼斯、图尔基耶、沙特阿拉伯及伊拉克等少数国家，眼部疾病在报告的HAdV-4病例中更为常见，该现象或因这些国家报告的HAdV-4病例较少而存在偏倚。1979至2006年间，日本历经多次HAdV-4流行，其中约82.3%的HAdV-4病例仅为眼部感染，尤以角结膜炎为主，此或与日本对HAdV-4眼部感染的检测更为积极相关。在2000年1月至2020年1月期间对PubMed及Embase组成的数据库进行的系统性审查与荟萃分析中，角结膜炎最常见由HAdV的D种引起，尤以HAdV-8为甚。值得注意的是，HAdV-8感染或导致更严重症状，如假膜形成、结膜充血及带血的眼分泌物。本研究中，所有患者均有所改善并出院，无死亡病例，此或因样本量小而存在偏差。Coleman等人系统回顾了1960至2020年间发表的144篇关于HAdV-4感染的文章，共报告14例儿童相关死亡病例，主要发生于美国、新加坡及中国，均死于呼吸道并发症。

本研究获取了2株病毒的全基因组序列及11株HAdV-4临床分离株的六邻体、五邻体、Fiber序列，进行系统发育分析。基于遗传距离的全基因组、六邻体、五邻体碱基及Fiber序列的系统发生树均形成两个分支（HAdV-4p与HAdV-4a），与既往REA研究结果及相关报告一致。研究发现，来自美国的原型菌株（RI-67株）属于HAdV-4p，主要分离于20世纪80年代之前。近期，美国仅检测到4株HAdV-4p毒株，分别来自2000年、2001年、2004年及2015年。HAdV-4a于1978年首次出现于法国，此后在日本、美国、中国等国家受到监测。近年来，HAdV-4a在各国的检测频率逐渐上升，渐次取代HAdV-4p成为主要流行毒株，与既往研究结论基本一致。

AdV-4a乃中国HAdV-4的主要亚型。中国所有HAdV-4毒株，包括本研究获得的临床毒株，自20世纪80年代以来一直与大多数外国毒株位于同一分支（HAdV-4a），且群内平均遗传距离非常接近（<0.002），表明本研究获得的菌株与来自不同国家和地区的大多数菌株具有较高的相似性，并且HAdV-4基因组在时间和地理空间上相对稳定，这将促进疫苗的免疫保护作用，与Li等所发现的一致。H根据相似性分析，本研究获得的HAdV-4分离株与中国近期流行株的全基因组及3个基因的核苷和氨基酸序列一致性分别不低于98%，平均遗传距离非常接近（' 001），表明中国流行的HAdV-4毒株基因组具有高度的保守性和稳定性。近期，Gonzalez等报道了HAdV-4可分为两个组（PG）：PG I与II，分别包括原型（p）样（4p）和a样（4a）基因组。既往研究表明，HAdV-4疫苗乃专门获准用于军事用途的非减毒p样毒株的活口服制剂，因此有必要开发新疫苗。

与原型菌株相比，本研究中获得的HAdV-4分离株在六邻体蛋白的抗原中和位点、Penton碱基蛋白的HVR 1和LGA环区以及Fiber蛋白的Knob区中存在氨基酸突变。中国流行的HAdV-4毒株与国外HAdV-4a亚型毒株表现出大致相同的氨基酸突变。之前的研究中也报告了类似的突变。然而，除了Hexon蛋白的Loop 2区域发生的氨基酸取代（N432 T）外，该取代在5个菌株中发现（Genbank登录号：KX384957、KX384946、AP014852、EF371058和AP014853）于1981年、1986年、2000年、2001年和2004年从美国分离的HAdV-4 p中几乎没有发现这些突变，表明这些突变可能与HAdV-4a和4p之间的毒力、致病性和流行率差异有关。Tian等人报道称，单克隆抗体MN4b对HAdV-4具有较强的中和活性，并且可以识别六邻体蛋白HVR7中的一个conformance表位（418AGSEK422）。体外成功构建了重组病毒rAd3-A4R7-1（在HAdV-3的六邻体区域含有HAdV-4的相关HVR7中和表位），并成功诱导出能够抑制HAdV-4感染的抗血清。以往的研究和本次研究均表明，上述表位的氨基酸极其保守，未发现任何氨基酸突变，这将为未来HAdV-4的预防和治疗提供新的思路。

在HAdV遗传学的研究领域中，重组现象作为其显著特征之一，对HAdV的进化起到了关键推动作用。过往研究揭示，HAdV-4的形成源于人畜共患病，具体而言，是SAdV-26基因组与HAdV-16六邻体基因的重组结果。本研究对两种HAdV-4菌株的重组分析亦得出类似结论，确认这两株菌株均由原型菌株演化而来。

中国多数序列（包括本研究中的11个分离株）及近年国外多数序列在ITR区域均检测到NF-I基序。此基序虽广泛存在于各类HAdV中，却未见于SAAdV、HAdV-4原型株及同期循环的分离株（含疫苗株）。再者，HAdV-4中的NF-I与种群B中的NF-I高度相似，这与Dehghan的研究发现相吻合，因此推测其可能源自种群B的重组。

NF-I对于病毒的有效复制非常关键，它可能促使病毒扩展至免疫未成熟群体，并助力HAdV-4适应新宿主，成为人畜共患病及宿主适应分子进化的典型例证。此重组事件首次记录于1978年，其出现或可解释近年来HAdV-4发病率逐渐上升的现象。然而，NF-I基序位于基因组前端，增加了测序难度，这或许是2019年北京分离的5个菌株中未检测到该基序的原因。

此外，本研究未发现HAdV-4的新重组，与其他研究结果一致，表明近年来循环的HAdV-4基因组相对稳定，疫苗的长期有效性得以维持。

这项研究存在下述局限性。首先，尽管样本来自中国北方和南方的六家医院，但中国幅员辽阔，本研究的结果并不能代表中国所有地区的ARI儿童的HAdV-4感染情况。其次，本研究仅包括住院的ARI儿童，HAdV-4阳性样本数量有限。