人偏肺病毒是一种常见的呼吸道病毒，属肺炎病毒科偏肺病毒属，2001年首次发现于荷兰，全球广泛分布，能够反复感染婴幼儿、老年人及免疫功能低下者，并引起急性呼吸道感染。目前，尚无有效的预防性疫苗批准上市。本文主要概述人偏肺病毒的病毒学和流行病学特征，介绍其潜在疫苗关键免疫原融合蛋白的结构和抗原位点，以及基于融合蛋白设计的亚单位疫苗、减毒活疫苗和核酸疫苗研究的最新进展。
人偏肺病毒(human metapneumovirus，hMPV)是一种常见的呼吸道病毒，能引起多种呼吸道疾病，尤其是对婴幼儿、老年人及免疫力低下者的健康构成较大威胁，更甚者会被重复感染。疫苗能够有效减少hMPV感染的发病率和病死率，由于其融合蛋白(fusion protein，F)具有特殊的构象变化，明确hMPV F蛋白上能介导中和抗体产生的抗原位点对疫苗设计至关重要。尽管目前尚无许可上市的hMPV疫苗，但已有2种疫苗进入临床试验阶段：减毒活疫苗rhMPV-Pa[1]和mRNA疫苗mRNA-1653[2]。同时，其他候选疫苗如嵌合蛋白疫苗、减毒活疫苗等的有效性和安全性也在动物实验中进行了评估。本文将综述hMPV的病毒学特征和流行病学特征，探讨F蛋白作为疫苗免疫原的机制，以及当前疫苗的研究进展。
1．病毒学特征
hMPV是肺炎病毒科偏肺病毒属的单股负链RNA病毒，病毒颗粒形状多样，包括球形、纤维形。其颗粒尺寸呈现出不均一性，平均直径为209 nm，包膜突起13～17 nm，核壳体平均直径17 nm，核壳体长度200～1 000 nm。
hMPV基因组按顺序编码9种蛋白质，其中F蛋白、附着糖蛋白(glycoprotein，G)和小疏水表面蛋白(small hydrophobic protein，SH)是病毒包膜糖蛋白，其他蛋白质包括核衣壳蛋白(nucleoprotein，N)、磷蛋白(phosphoprotein，P)、基质蛋白(matrixprotein，M)、转录延伸因子(M2-1)、RNA合成调节因子(M2-2)和主要聚合酶亚基(L)。
全基因组分析显示，hMPV可分为A和B两种基因型；
根据G蛋白和F蛋白的序列变异性，这两种基因型又进一步分为A1和A2、B1和B2亚型，A2亚型还可再细分为A2a和A2b。
F蛋白：介导病毒附着和融合过程，有较强的免疫原性。
G蛋白：是一种重要的毒力因子，能够靶向干扰维甲酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ)依赖的基因转录、阻断线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)激活、抑制气道上皮细胞中的固有免疫信号传导、影响CD4＋T细胞活化，从而削弱宿主免疫应答，增强病毒的感染性和致病性。
M蛋白：在体外能诱导抗原提呈细胞的活化，活化后的树突状细胞可以刺激T淋巴细胞产生IL-2和IFN-γ，因此将M蛋白作为hMPV亚单位疫苗的一种有效成分，可能会提供更平衡且更强大的免疫效应。
有文献报道M2基因缺失会影响hMPV的复制和RNA合成，因此具备用于制作减毒活hMPV疫苗的潜力。
2．流行病学特征
hMPV在世界范围内均有流行，且具有季节性分布的特点，感染高峰主要出现在春季和冬季。
在全球范围内，急性呼吸道疾病住院和门诊儿童中有6%～40%的儿童感染hMPV，2岁以下儿童高度易感，未发现性别差异。2006—2007年，A、B型毒株在我国广东地区均有流行。
hMPV作为呼吸道病毒的一种，通过飞沫传播，且潜伏期存在个体差异，通常为3～5 d。感染后的症状包括呼吸道感染、喘息、哮喘和肺炎，偶然会引发炎症局部暴发；感染后一般病情较轻，个别须警惕混合感染、反复感染后而演变为重症肺炎。
不同基因型、基因亚型的hMPV可交替成为流行优势株，但不同基因型hMPV与疾病严重程度的相关性结论不一，需进一步研究。
目前，hMPV感染的治疗方法以支持治疗为主，利巴韦林、免疫球蛋白、融合抑制剂和小干扰RNA虽然可控制和治疗hMPV感染，但疫苗仍是最好的预防措施。
F蛋白是hMPV最为重要的表面糖蛋白，在不同亚型之间高度保守，是hMPV治疗性单克隆抗体、疫苗研发等最具吸引力的靶标。
1．F蛋白
F蛋白是hMPV进入细胞所必需的一种Ⅰ类融合糖蛋白，它作为三聚体存在于病毒粒子的表面，促进病毒和宿主细胞膜的融合。F蛋白在基因型A和B以及4个亚组A1、A2、B1、B2中高度保守，同源性约91%。
单体F蛋白：在感染细胞中表达为未成熟的前体F0，可被细胞外的胰蛋白酶切割，裂解产生2个亚基F2和F1；
成熟的F蛋白：是二硫键连接的F2/F1异二聚体三聚体，形成亚稳态预融合(PreF)构象。在未知刺激或热力学不稳定性刺激下，PreF蛋白三级结构大量重排，蛋白N末端延伸并插入疏水融合肽F1亚基进入宿主细胞膜。之后，这种融合前中间体会自行坍塌，F1 N末端疏水融合肽(fusion peptide，FP)会将自身插入靶细胞膜，将病毒和宿主膜连接，形成杆状稳定的融合后构象(PostF)。
机体抗hMPV感染主要通过中和抗体介导，抗体可以阻断F蛋白的重折叠，从而阻断膜融合过程达到抗hMPV的效果。
2．抗原位点
与同属于副粘病毒科的呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)F蛋白特异性单克隆抗体不同，hMPV F蛋白单克隆抗体的抗体反应对其抗原顶点的显性较小，并且大多数强效中和单克隆抗体可识别hMPV F蛋白一侧的表位。已知的hMPV F蛋白表位包括位点Ø、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和66～87螺旋。
在hMPV F蛋白的位点Ø处，能观察到致密大聚糖屏蔽，很少有其他抗原位点与位点Ø竞争，所以宿主免疫应答不会引发针对该位点的抗体。
Ⅰ位点上的抗原表位DS7是所有4种hMPV亚型共有的有效中和位点，也是第一个具有hMPV F蛋白结构特征的抗原表位。
位点Ⅱ：位于位点Ⅲ和Ⅰ之间，是单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)M1D2和M1C7的靶标，该表位在hMPV PreF和PostF构象中保守，故该位点特异性的McAb均可以与PreF和PostF结合。
hMPV F蛋白Ⅳ位点：与RSV F蛋白相似，是交叉中和抗体和Ⅳ位点结合抗体101F、54G10和17E10的靶点；McAb MPV481具有hMPV F蛋白特异性，可在Ⅳ位点与hMPV PreF前和PostF结合，并适度中和病毒。
hMPV F蛋白上新发现的66～87螺旋位点：存在于PreF构象中，但是在PostF构象中部分被破坏，并且在亚群中高度保守。
位点Ⅴ：是融合前特异性表位，位于hMPV F蛋白三聚体头部的位点Ø附近，具有有效的中和作用。
3．PreF与PostF构象抗原位点的差别
RSV的PreF构象比PostF构象免疫原性更高，而稳定的hMPV PreF和PostF的免疫原性相当，可能是由于hMPV除了位点Ø和位点Ⅴ是PreF特有的，其他4个位点均能在PreF和PostF构象中找到，且这些位点都有抗体结合靶点。
PreF构象存在结构不稳定和表达量低两个问题，会发生PreF和PostF构象之间的瞬时转变，目前的F蛋白疫苗多用的是PreF和PostF蛋白的混合物。
Yim等研究中的动物实验证明，针对位点Ⅴ的McAb MPV467是最有效的单克隆抗体，具有更高的中和活性，而位点Ⅴ只在PreF构象中存在，因此认为PreF比PostF的免疫原性更高。关于hMPV F蛋白两种构象哪种能引发更高的中和活性，目前尚无定论。
PreF与PostF蛋白三聚体结构如图1所示。
图1 人偏肺病毒融合蛋白融合前和融合后三聚体结构
4．RSV和hMPV的F蛋白比较
RSV和hMPV的F蛋白在结构上高度相似，均为三聚体，并且具有30%的氨基酸序列同源性。两种F蛋白都属于Ⅰ类病毒融合蛋白家族，F0前体裂解成F1和F2亚基，2个亚基通过2个二硫键连接，形成成熟的亚稳态同源三聚体。
RSV F有两个弗林(Furin)蛋白酶切割位点，F1和F2之间的p27片段被去除；hMPV F只有1个可被宿主膜蛋白酶TMPRSS2切割的切割位点。
MPE8(位点Ⅲ)、101F(位点Ⅳ)、54G10(位点Ⅳ)和M1C7(位点Ⅴ)抗体可同时结合RSV和hMPV的F蛋白。
hMPV PreF和PostF结构表明，hMPV F蛋白与RSV F蛋白具有结构同源性，从而可以根据RSV F蛋白的中和表位预测hMPV F蛋白上的对应物。
hMPV与RSV的F蛋白抗原位点及McAb对比见表1。
表1 人偏肺病毒与呼吸道合胞病毒融合蛋白抗原位点的单克隆抗体对比
目前，针对hMPV F蛋白设计的疫苗类型主要有亚单位疫苗、减毒活疫苗、mRNA疫苗，其中F蛋白亚单位疫苗是最具潜力的疫苗类型之一。
1．基于F蛋白设计的亚单位疫苗
基于F蛋白设计的免疫原包括PreF、PostF、RSV F蛋白头部与hMPV F蛋白茎部嵌合等形式。
(1)PreF
由于PreF和PostF间会发生构象转变，可以通过改变F蛋白的部分区域得到稳定的融合前构象。Hsieh等通过4种方法对F蛋白进行改造：
①在特定区域添加二硫键，起到稳定构象的作用；
②在蛋白质结构折叠处引入脯氨酸，起到固定折叠的作用；
③改变某些氨基酸位点的极性可以对抗蛋白质内部电荷不平衡；
④使用空腔填充氨基酸的方法增强蛋白质内部的疏水作用力，使结构更加紧密。
研究发现，2个二硫键的变构体(DSx2)能增加蛋白质表达，之后为了探索有益的单一取代组合后在多大程度上具有累加效应，又筛选出包含所有有益取代的变体DSx2-CavEs，在其顶部再加1个二硫键并将H368N恢复到野生型His368后产生MM-H1。改进后产生MM-H4，用E453Q替代MM-4H后命名为DS-CavEs2。相比之下，DS-CavEs2的表达提高了10倍，并表现出高热稳定性(熔解温度71.8℃)。
用稳定的PreF蛋白处理血清，能显著消耗DS-CavEs2免疫小鼠血清中的中和抗体活性；而PostF蛋白未能大量消耗DS-CavEs2免疫后小鼠血清的中和抗体活性，表明DS-CavEs2免疫主要引发融合前F蛋白特异性抗体，是优越的疫苗抗原。
基于融合前RSV F蛋白构建体的经验，将hMPV C-85473毒株(GenBank：KM408076.1)的野生型(WT)F基因插入pcDNA3.1＋载体中，进行定点诱变以产生6种不同的hMPV F蛋白。经动物实验后发现，与其他5种非佐剂组蛋白疫苗相比，融合前蛋白454-HQWH-457可显著降低小鼠的肺泡内炎症和总炎症。
研究发现，通过在人胚胎肾上皮(293-F)细胞中表达M和F蛋白获得的rhMPV-F能够诱导特异性IgG抗体并识别F蛋白表位的CD8＋T细胞反应。
明矾虽然是hMPV-F亚单位疫苗的有效佐剂，但通常会引发个体不良反应，包括高Th2/Th1反应和肺部病理损伤；
油包水佐剂或α-半乳糖神经酰胺则可增强小鼠的中和抗体反应，且在接种疫苗后不会在病毒攻击后导致呼吸道疾病加重。
故而佐剂的选择也是今后hMPV疫苗研发的重要部分。
(2)PostF
为了得到稳定的PostF蛋白，Más等[16]基于RSV表达融合后蛋白的策略，将携带hMPV的A1亚系NL/1/00毒株或携带B1亚系的NL/1/99毒株中F基因的pCAGG质粒扩增，将扩增后的DNA插入到用相同酶消化的pRB21质粒中。
首先，B1亚谱系已经在294位具有Glu，将G294E引入A1亚谱系的F蛋白中，使氨基酸发生变化；
然后，在F蛋白胞外结构域的C末端添加折叠三聚体化结构域，以便其后续形成三聚体；
PCR进一步诱变，将RSV F蛋白的切割位点Ⅱ序列插入hMPV F蛋白切割位点，可以在不添加胰蛋白酶的情况下促进可溶性hMPV F蛋白三聚体的裂解；
删除融合肽的前9个残基以防止蛋白质聚集；
最后将整个构建体插入到牛痘病毒重组体中。
感染这种重组病毒后CV-1细胞会产生一种可溶性F蛋白并分泌到培养基中，将该蛋白质纯化后即可得到稳定的融合后hMPV A1 F蛋白。动物实验表明，接种hMPV F蛋白的小鼠血清与同源、异源hMPV PostF蛋白结合均产生高水平抗体，且同源hMPV F蛋白的结合滴度显著高于异源hMPV F蛋白，这种蛋白质的改造方式是潜在的疫苗研发方法之一。
在得到稳定的融合后hMPV A1 F蛋白的基础上，为了合成融合后hMPV B2 F蛋白需要将重组表达的hMPV B2 F蛋白用胰蛋白酶消化诱导其裂解，并通过尺寸排阻色谱分离单体和三聚体hMPV F蛋白。单体hMPV B2 F组分是基于hMPV B2 F蛋白的X射线晶体结构和中和McAb MPV458的预融合构象，在55°C下加热将所有颗粒转化为融合后构象。
用融合后hMPV B2 F蛋白接种小鼠，发现其主要引发靶向抗原位点Ⅲ和Ⅳ的中和抗体。抗原位点Ⅳ在hMPV PreF和PostF构象中均构象保守；抗原位点Ⅲ可引发融合前特异性抗体(如MPE8)以及结合融合前和融合后构象的抗体。融合后hMPV B2 F蛋白与TiterMax水包油佐剂一起使用能平衡Th1/Th2免疫应答，减轻肺部病理变化，并且能限制小鼠肺部病毒复制。
(3)RSV和hMPV融合蛋白的嵌合形式
大多数人B细胞靶向RSV F蛋白的头部，Huang等将RSV F头部和hMPV F茎嵌合，将F蛋白的免疫显性表位结合成单个抗原，制成RHMS-1。
基于RSV F(5UDE)和hMPV F(5WB0)的预融合结构设计的融合前结构RHMS-1蛋白保留了hMPV F结构的信号肽、两个切割位点、DsCav1突变(S115C、S190F、V207L、S290C)和RSV F的融合肽。RHMS-1保留RSV F和hMPV F的免疫学特征，保持了来自RSV F和hMPV F蛋白抗原表位上的构象结构，使其可被表位特异性单克隆抗体和预先暴露于RSV或hMPV的人B细胞识别。
这是第一个能诱导有效中和抗体并交叉保护小鼠免受RSV和hMPV攻击的免疫原，尺寸略大于RSV F三聚体蛋白。动物实验表明，RHMS-1是一种很有前景的泛肺病毒疫苗。
基于hMPV F和RSV F抗原位点Ⅱ结构有相似性的这一特点，某些氨基酸可以在两种蛋白质之间交换而不会破坏整体局部折叠。hRSV F残基取代等效融合后的hMPV F残基，能产生嵌合蛋白F-414、F-415和F-416，其中F-414的表达水平与F-415的表达水平相同。
F-415中hMPV F位点Ⅱ的大部分C端螺旋是通过交换每种蛋白质特有的7个氨基酸而形成的；
F-416蛋白在hMPV F骨架中增加了另外6个氨基酸变化，几乎完全复制了hRSV F位点Ⅱ的氨基酸序列。
以融合后RSV F和hMPV F作为对照，评估F-415和F-416嵌合体在小鼠体内的免疫原性，发现F-415嵌合体诱导的抗体不仅与hMPV F结合，而且与RSV融合后F蛋白都显示出实质性的结合，同时F-416与融合后hRSV F抗体结合水平高于hMPV WT，可以起到交叉保护的作用。
2．减毒活疫苗
通过改变病毒主要免疫原的糖基化，可以达到减毒效果从而研发疫苗。
Liu等诱变hMPV NL/1/00毒株将其F蛋白中172处氨基酸的N-连接碳水化合物去除，开发了一种减毒活疫苗(M2)。在研究中用同源病毒反复感染小鼠模型后，发现单次免疫能够完全抑制病毒在肺部的复制。
目前，没有评估M2接种和激发后病毒在上呼吸道的复制，也没有检测病毒特异性IgA水平，尚不清楚M2是否能够保护啮齿动物免受上呼吸道hMPV感染以及高中和抗体滴度维持的时间长短。但是，同源病毒感染BALB/c小鼠时减毒毒株M2能够完全保护下呼吸道，并对异源病毒感染提供部分交叉保护，但这种减毒活疫苗还需要进一步改进。
3．基于F蛋白设计的核酸疫苗
mRNA-1653是针对hMPV和副流感病毒3型(PIV3)的mRNA联合疫苗，由编码hMPV和PIV3 F蛋白的两个不同的mRNA序列编码封装在脂质纳米颗粒中的hMPV和PIV3的天然膜锚定融合糖蛋白制备。
评估mRNA-1653的安全性、反应原性和免疫原性(方案编号mRNA-1653-P101；NCT03392389)[2]的临床试验中期分析表明，mRNA-1653疫苗在所有剂量水平下耐受性良好，所有受试者在基线时均存在针对hMPV和PIV3的中和抗体。
单剂量mRNA-1653提高了针对hMPV和PIV3的血清中和抗体滴度，并且在所有剂量水平下增强的程度相似，是预防由hMPV和PIV3引起的呼吸道疾病的一种较好的防御措施。
目前，尚无针对hMPV的疫苗或特效药上市，因此优化疫苗设计或现有策略是非常必要的。减毒活疫苗rhMPV-pa和mRNA疫苗mRNA-1653的安全性和免疫原性临床试验已经开展，rhMPV-pa在血清阴性儿童中过度减毒；mRNA-1653的临床试验在2022年已结束评估，但尚未发表最终结果。减毒活疫苗相关技术已经发展了几十年，但是要适当的平衡免疫原性和安全性是比较困难的，未来仍是需要攻克的方向。大部分F蛋白的亚单位疫苗都是在PreF的基础上加以改造以获得优越的免疫原，而这些候选疫苗的进一步临床研究都应包括对免疫原性强度和保护时间的评估，更应注意涉及特定模型的实验，以估计hMPV激发后的呼吸病理。考虑到RSV和hMPV的结构相似，在hMPV研发过程中可以借鉴RSV疫苗研发方式，或许可以克服hMPV疫苗研发中的一些主要障碍，如减少免疫后引起Th1/Th2不均衡而引起的Th2过敏反应，或者诱导更具有针对性的局部呼吸道免疫应答。
作者：王怡丹 李智华 毕研伟 李倩倩
中国医学科学院医学生物学研究所，病原体感染防控教育部重点实验室（北京协和医学院）；云南大学生命科学学院
引用本文: 王怡丹, 李智华, 毕研伟, 等. 人偏肺病毒融合蛋白疫苗研究进展 [J] . 中华微生物学和免疫学杂志, 2024, 44(7) : 608-613. DOI: 10.3760/cma.j.cn112309-20240429-00153.
来源：中华微生物学和免疫学杂志